siRNA沉默ADAM10基因?qū)︻愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞凋亡的影響

王培，楚天舒，閻磊，劉冰，朱清，邵鳳民

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siRNA沉默ADAM10基因?qū)︻愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞凋亡的影響

王培，楚天舒，閻磊，劉冰，朱清，邵鳳民

450003 鄭州，河南省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（王培、楚天舒），腎病科（閻磊、劉冰、朱清、邵鳳民）

探討小干擾 RNA（siRNA）沉默解整合素金屬蛋白酶（ADAM10）基因?qū)︻愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞凋亡的影響。

將ADAM10 特異性 siRNA 轉(zhuǎn)染人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞 MH7A 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為 3 組，ADAM10-siRNA 組轉(zhuǎn)染 ADAM10 特異性 siRNA，NC-siRNA 組轉(zhuǎn)染 ADAM10 非特異性 siRNA，對照組為未經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的 MH7A 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 48 h后采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組細(xì)胞中 ADAM10 表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，qRT-PCR 檢測凋亡相關(guān)基因 B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和 Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（Bax）表達(dá)水平，ELISA 測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）含量。

ADAM10-siRNA 組細(xì)胞中 ADAM10 mRNA 和蛋白表達(dá)水平較 NC-siRNA 組和對照組低（< 0.05）。沉默 ADAM10 基因后，ADAM10-siRNA 組細(xì)胞凋亡率顯著高于 NC-siRNA 組和對照組（< 0.05）。ADAM10-siRNA 組細(xì)胞中 Bax 基因表達(dá)水平明顯高于 NC-siRNA 組和對照組（< 0.05），Bcl-2 基因表達(dá)水平明顯低于 NC-siRNA 組和對照組（< 0.05）。ADAM10-siRNA 組細(xì)胞分泌的 TNF-α、IL-6 和 IL-8 顯著低于 NC-siRNA 組和對照組（< 0.05）。而 NC-siRNA 組和對照組以上各指標(biāo)相比較，差異不明顯（> 0.05）。

沉默 ADAM10 基因可明顯促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的凋亡，并進(jìn)一步減少 TNF-α、IL-6 和 IL-8 等炎癥因子的分泌，提示通過沉默 ADAM10 基因使減輕/控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎癥成為可能。

關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕； 滑膜成纖維細(xì)胞； 解整合素金屬蛋白酶 10； 細(xì)胞凋亡

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以累及關(guān)節(jié)為主的慢性全身性系統(tǒng)性自身免疫疾病，其病理特征在于滑膜過度增生，炎性單核細(xì)胞浸潤，繼而造成關(guān)節(jié)炎癥、破壞及功能障礙[1]。越來越多的證據(jù)表明，RA 滑膜中存在高度活化的滑膜成纖維細(xì)胞（synovial fibroblasts，SFs），SFs 可通過產(chǎn)生促進(jìn)軟骨破壞的促炎癥細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6 和IL-8 等）和蛋白酶在 RA 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-3]。近期研究表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞不但高度活化，釋放炎癥因子，并且存在凋亡受阻[4]。解整合素金屬蛋白酶 10（adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）屬于 ADAM 家族成員，是一種跨膜蛋白，參與多種炎性和退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展[5-6]。先前的研究表明 ADAM10 在 RA 滑膜組織中過表達(dá)，且在 RA 的滑膜成纖維細(xì)胞的增殖及血管生成中起關(guān)鍵作用[7]。據(jù)報道，沉默 ADAM10 能夠抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖、擴(kuò)散、遷移和侵襲[8]。然而，ADAM10 是否介導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞凋亡的研究鮮有報道。因此，本研究通過構(gòu)建 ADAM10 特異性 siRNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞 MH7A 細(xì)胞，觀察沉默 ADAM10 基因?qū)?MH7A 細(xì)胞凋亡及對炎癥因子的影響，為揭示 RA 可能的機(jī)制及基因靶向治療提供可能的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞 MH7A 細(xì)胞株購自日本 RIKEN 生物資源中心；DMEM 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自美國 Hyclone 公司；ADAM10 特異性siRNA 及ADAM10 非特異性siRNA 購自上海吉瑪制藥有限公司；Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、Trizol 試劑購自美國 Invitrogen 公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國 Promega 公司；SYBR Primix Ex Taq 檢測試劑盒購自日本 Takara 公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；RIPA 細(xì)胞裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ADAM10 兔抗人單抗購自美國 Cell Signal 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG 二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-6、IL-8 ELISA 檢測試劑盒購自美國Bio-Techne 公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MH7A 細(xì)胞培養(yǎng)在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中，置 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)，每 2 天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長匯合率達(dá) 90% 時，使用胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 轉(zhuǎn)染前 24 h 將處于對數(shù)生長期的MH7A 細(xì)胞接種于 6 孔板中，放置于 37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長匯合約 50% 時，根據(jù)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，使用的 siRNA 終濃度為 40 nmol/L，將轉(zhuǎn)染ADAM10 特異性 siRNA 的 MH7A 細(xì)胞記為 ADAM10-siRNA 組，轉(zhuǎn)染 ADAM10 非特異性 siRNA的 MH7A 細(xì)胞記為 NC-siRNA 組，未進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理的 MH7A 細(xì)胞記為對照組。將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞置 37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后分別收集各組細(xì)胞及培養(yǎng)上清液。

1.2.3 qRT-PCR 檢測 分別收集轉(zhuǎn)染 48 h 后的各組MH7A 細(xì)胞，按照 Trizol 試劑說明書提取細(xì)胞中總 RNA，經(jīng)蛋白核酸微量檢測儀測定 RNA 濃度和純度，選取260/280比值在 1.8 ~ 2.0 間的 RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系配置及反應(yīng)程序設(shè)定均參照 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，合成 cDNA。以 cDNA 為模板，采用 SYBR Primix Ex Taq 檢測試劑盒進(jìn)行定量檢測，采用 20 μl 反應(yīng)體系。反應(yīng)采用 GAPDH 為內(nèi)參，統(tǒng)計每孔 Ct 值，使用 2-ΔΔCt法分析各組細(xì)胞中ADAM10 mRNA 相對表達(dá)水平。引物：ADAM10 F：5' CTGCCCAGC ATCTGACCCTAA 3'，R：5' TTGCCATCAGAACTG GCACAC 3'；Bax F：5' GGGAGACACCTGAGCTG ACC 3'，R：5' GGACTCCAGCCACAAAGATGG 3'；Bcl-2 F：5' GAACTGGGGGAGGATTGTGGCC 3'，R：5' TCGACGTTTTGCCTGAAGACTGTTAA 3'；GAPDH F：5' ACCACAGTCCATGCCATCAC 3'，R：5' CCACCACCCTGTTGCTGTAG 3'。

1.2.4 Western blot 檢測 轉(zhuǎn)染 48 h 后收集各組 MH7A 細(xì)胞，加入 RIPA 細(xì)胞裂解液，于冰上提取細(xì)胞中總蛋白。以 BCA 蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，SDS 上樣緩沖液與蛋白按比例混合，在沸水浴中加熱 15 min 致蛋白變性，取 40 μg 蛋白樣品加到上樣孔中，行 SDS-PAGE 電泳，分離蛋白后以半干法轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶粉進(jìn)行封閉 2 h。加入1:1000 稀釋的ADAM10 一抗，4 ℃過夜孵育。TBST 洗膜 15 min，洗滌3 次，加入1:3000 稀釋的二抗，室溫孵育 1 h。TBST 洗膜 15 min，洗滌3 次，加入 ECL 化學(xué)發(fā)光液顯色，轉(zhuǎn)移至暗室，曝光，以GAPDH 為內(nèi)參，使用 Image J 圖像分析軟件統(tǒng)計分析，計算各組細(xì)胞中ADAM10 蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測 各組 MH7A 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，以預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，離心收集細(xì)胞，加入 100 μl 結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞，分別向細(xì)胞中加入Annexin V-FITC 和 PI 染液各5 μl，室溫避光反應(yīng) 30 min，再向細(xì)胞中加入 400 μl 結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測，統(tǒng)計各組 MH7A 細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 ELISA 檢測 各組 MH7A 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 48 h 后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù) ELISA 檢測試劑盒說明書測定上清液中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 水平。使用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 波長處吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染 siRNA 對 MH7A 細(xì)胞中 ADAM10 表達(dá)的影響

qRT-PCR 和Western blot 檢測結(jié)果見表 1 和圖 1，ADAM10-siRNA 組 MH7A 細(xì)胞中 ADAM10 mRNA 和蛋白表達(dá)水平相比 NC-siRNA 組和對照組均明顯下調(diào)（< 0.05）。NC-siRNA 組和對照組間 ADAM10 mRNA 和蛋白表達(dá)水平差異不顯著（> 0.05）。提示在 MH7A 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ADAM10-siRNA 能夠有效沉默 ADAM10 基因及抑制 ADAM10 蛋白表達(dá)。

表 1 轉(zhuǎn)染 48 h 后各組 MH7A 細(xì)胞中ADAM10 mRNA和蛋白水平比較（）

注：與對照組比，*< 0.05；與NC-siRNA 組比，&< 0.05。

Notes: Compared with the control group,*< 0.05; compared with the NC-siRNA group,&< 0.05.

2.2 沉默 ADAM10 基因?qū)?MH7A 細(xì)胞凋亡的影響

沉默 ADAM10 基因后采用流式細(xì)胞儀檢測各組 MH7A 細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，ADAM10-siRNA 組細(xì)胞凋亡率相比NC-siRNA 組和對照組明顯升高（< 0.05）。NC-siRNA 組和對照組間細(xì)胞凋亡率差異不明顯（> 0.05），見表 2 和圖 2。說明沉默 ADAM10 基因能夠誘導(dǎo) MH7A 細(xì)胞凋亡。

2.3 沉默 ADAM10 基因?qū)?MH7A 細(xì)胞中 Bcl-2 和 Bax 蛋白表達(dá)的影響

采用qRT-PCR 檢測各組 MH7A 細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因 Bcl-2 和 Bax 表達(dá)水平，結(jié)果如表 3 所示，ADAM10-siRNA 組細(xì)胞中 Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平相比 NC-siRNA 組和對照組明顯下調(diào)（< 0.05），Bax mRNA 表達(dá)水平明顯上調(diào)（< 0.05）。NC-siRNA 組和對照組間 Bcl-2 和 Bax 基因表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）。提示沉默 ADAM10 基因能夠下調(diào) Bcl-2 的表達(dá)，上調(diào) Bax 的表達(dá)。

圖 1 Western blot 檢測各組 MH7A 細(xì)胞中 ADAM10 蛋白水平

Figure 1 Western blot analysis of ADAM10 protein levels in MH7A cells of each group

表 2 沉默 ADAM10 基因?qū)?MH7A 細(xì)胞凋亡的影響（）

注：與對照組比，*< 0.05；與NC-siRNA 組比，&< 0.05。

Notes: Compared with the control group,*< 0.05; compared with the NC-siRNA group,&< 0.05.

2.4 沉默 ADAM10 基因?qū)?MH7A 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 含量的影響

采用ELISA 測定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6 和 IL-8 含量，ADAM10-siRNA 組細(xì)胞上清液中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 相比 NC-siRNA 組和對照組明顯降低（< 0.05）。NC-siRNA 組和對照組間細(xì)胞上清液中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 含量差異不明顯（> 0.05），見表 4。提示沉默 ADAM10 基因能夠抑制細(xì)胞分泌 TNF-α、IL-6 和 IL-8。

圖 2 流式細(xì)胞儀檢測各組 MH7A 細(xì)胞凋亡率

Figure 2 Flow cytometry to detect apoptosis rate of MH7A cells in each group

表 3 沉默 ADAM10 基因?qū)?MH7A 細(xì)胞中 Bcl-2和 Bax 基因 mRNA 表達(dá)的影響（）

注：與對照組比，*< 0.05；與NC-siRNA 組比，&< 0.05。

Notes: Compared with the control group,*< 0.05; compared with the NC-siRNA group,&< 0.05.

3 討論

目前已有大量研究證實(shí)，RA 患者滑膜中的滑膜成纖維細(xì)胞不但存在過度增殖，還存在凋亡不足[9-10]。因此，有效誘導(dǎo)滑膜成纖維細(xì)胞的凋亡，也可能是治療 RA 的方法之一。在 Isozaki 等[11]研究中，發(fā)現(xiàn) ADAM10 在人 RA 滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高；后續(xù)研究發(fā)現(xiàn) ADAM10 在 RA 患者的滑膜組織及滑液中均呈高表達(dá)，沉默 ADAM10 能夠抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖、擴(kuò)散、遷移和侵襲，然而其是否能夠影響滑膜成纖維細(xì)胞的凋亡尚未可知。ADAM10 在乳腺癌、結(jié)直腸癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等常見惡性腫瘤中亦呈高表達(dá)[12]。Zhang 等[13]研究，通過轉(zhuǎn)染 siRNA 敲除肝癌細(xì)胞中 ADAM10 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞凋亡增加。Fu 等[14]研究指出，ADAM10 可調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡及化療耐藥。提示 ADAM10 可能參與細(xì)胞凋亡過程，因此，本實(shí)驗(yàn)通過在人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞 MH7A 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 ADAM10 特異性 siRNA，有效降低了 MH7A 細(xì)胞中 ADAM10 表達(dá)的水平。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，沉默 ADAM10 基因后，MH7A 細(xì)胞凋亡率顯著升高。qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)沉默 ADAM10 基因的 MH7A 細(xì)胞中 Bcl-2 mRNA 表達(dá)明顯降低，而 Bax mRNA 表達(dá)明顯升高。Bax 和Bcl-2 是細(xì)胞凋亡中研究最多、最透徹的基因，其中 Bax 是促凋亡基因，而 Bcl-2 是抑制細(xì)胞凋亡的基因[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默 ADAM10 基因后 Bax 表達(dá)升高，Bcl-2 表達(dá)降低，提示沉默ADAM10 基因可能通過調(diào)節(jié) Bcl-2、Bax 的表達(dá)水平進(jìn)而使滑膜成纖維細(xì)胞凋亡增加。這與近期Guo 等[16]研究結(jié)果一致—— miR-152 通過靶向 ADAM10 抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

表 4 沉默 ADAM10 基因?qū)?MH7A 細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-8含量的影響（）

注：與對照組比，*< 0.05；與NC-siRNA 組比，&< 0.05。

Notes: Compared with the control group,*< 0.05; compared with the NC-siRNA group,&< 0.05.

眾多研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者滑膜成纖維細(xì)胞能夠分泌包括 TNF-α、IL-6 和 IL-8 在內(nèi)的多種炎癥因子，炎癥因子又可進(jìn)一步促進(jìn)滑膜成纖維母細(xì)胞的增生，兩者均參與 RA 的發(fā)生與發(fā)展，TNF-α 是熟知的參與 RA 發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵炎癥因子，使用 TNF-α 抑制劑治療 RA 在臨床上被證實(shí)是安全有效的[17]。此外，研究證實(shí)，IL-6 和 IL-8 在 RA 患者的血清和滑液中呈高濃度存在，在 RA 的發(fā)生發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用，參與關(guān)節(jié)組織的破壞[18]。越來越多的證據(jù)表明 ADAM 家族參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，該家族的成員可以作為治療炎性疾?。ò?RA）的新型治療靶點(diǎn)[19]。因此，本研究設(shè)想，是否可以通過沉默 ADAM10 基因影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞炎癥因子的分泌。結(jié)果顯示 ADAM10 可調(diào)節(jié)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞分泌 TNF-α、IL-6 和 IL-8 等炎癥因子。因此，ADAM10 有可能作為治療RA 的新型治療靶標(biāo)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 siRNA 沉默 ADAM10 基因能夠有效促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的凋亡，減少炎癥因子釋放，提示 ADAM10 可能作為 RA 基因治療中的潛在作用靶點(diǎn)。

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Effect of ADAM10 gene silencing on apoptosis of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis

WANG Pei, CHU Tian-shu, YAN Lei, LIU Bing, ZHU Qing, SHAO Feng-min

Department of Immunology and Rheumatology (WANG Pei, CHU Tian-shu), Department of Nephropathy (YAN Lei, LIU Bing, ZHU Qing, SHAO Feng-min), Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003, China

To investigate the effect of ADAM10 gene silencing on apoptosis of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis.

ADAM10-specific siRNA was transfected into human rheumatoid arthritis synovial fibroblast MH7A cells. The experiment was divided into 3 groups: ADAM10-siRNA group, NC-siRNA group and control group, which were transfected with ADAM10-specific siRNA, ADAM10 non-specific siRNA or nothing, respectively. After 48 h of transfection, qRT-PCR and Western blot were used to detect the expression of ADAM10 in each group. Flow cytometry was used to detect apoptosis. The expression levels of apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax were detected by qRT-PCR. The levels of TNF-α, IL-6 and IL-8 in the cell culture supernatant were determined by ELISA.

The expression of ADAM10 mRNA and protein in the ADAM10-siRNA group was significantly lower than that in NC-siRNA group and control group (< 0.05). After silencing the ADAM10 gene, the apoptosis rate of the ADAM10-siRNA group was significantly higher than that of the NC-siRNA group and the control group (< 0.05). The expression of Bax gene in ADAM10-siRNA group was significantly higher than that in NC-siRNA group and control group (< 0.05). The expression level of Bcl-2 gene was significantly lower than that in NC-siRNA group and control group (< 0.05). TNF-α, IL-6 and IL-8 secreted by ADAM10-siRNA group were significantly lower than those of NC-siRNA group and control group (< 0.05). Compared with the above indexes in the NC-siRNA group and the control group, the difference was not significant (> 0.05).

ADAM10 gene silencing can significantly promote the apoptosis of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and further reduce inflammatory factors such as TNF-α, IL-6 and IL-8, suggesting that silencing of ADAM10 gene makes it possible to reduce/control rheumatoid arthritis inflammation.

Arthritis, rheumatoid; Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts; ADAM10 gene; Apoptosis

SHAO Feng-min, Email: 250478232@qq.com

2017 年河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項(xiàng)目（201702180）

邵鳳民，Email：250478232@qq.com

2018-12-17

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.006