山葵浸提液消除食品中亞硝酸鹽的研究

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(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，成都 610106)

亞硝酸鹽是日常食物中常見的一種致癌物質(zhì)前體，其進(jìn)入人體后能與次級(jí)胺結(jié)合,形成亞硝胺,誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變,對(duì)人體健康造成威脅[1]。亞硝胺是一類化學(xué)致癌物質(zhì),因此阻斷亞硝胺合成或消除亞硝酸胺的前體是防治癌病產(chǎn)生的有效途徑之一[2，3]。我國食品衛(wèi)生法規(guī)定了腌制品中亞硝酸鹽含量應(yīng)小于30 mg/kg[4，5]。日常飲食中許多物質(zhì)中均存在超標(biāo)的亞硝酸鹽：如不新鮮或過度施用氮肥的蔬菜、不新鮮的水果、臘肉、泡菜、醬腌菜等[6，7]。實(shí)際上，如果人們?cè)谥参锓N植過程中采用正確的種植方法，同時(shí)消費(fèi)者正確選擇食物，亞硝酸鹽對(duì)人體造成的影響會(huì)減小很多。比如菜農(nóng)適量施加氮肥，消費(fèi)者不去購買不新鮮的蔬菜水果，盡量少吃臘肉、醬腌菜等含亞硝酸鹽高的食物，但是在現(xiàn)實(shí)生活中卻很難做到。因此，尋找一個(gè)能快速消除亞硝酸鹽并且不會(huì)帶入新的有害物質(zhì)的材料具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。山葵植物體自身含有豐富的Vc、異硫氰酸酯類化合物和硒等物質(zhì)[8]，其中已知的Vc、硒物質(zhì)能有效抑制亞硝胺的合成[9]。同時(shí)山葵本身具有獨(dú)特風(fēng)味，能對(duì)食物起到很好的調(diào)味作用。本文敘述了通過條件優(yōu)化尋找山葵浸提液消除亞硝酸鹽的最優(yōu)條件，同時(shí)將山葵浸提液用于部分食品中亞硝酸鹽的消除，效果明顯。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

山葵根莖：廣元市生物科技璽府公司；對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、NaNO2、硼砂、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀：均為分析純；臘肉(腌制4天，保存1個(gè)月)、酸菜(腌制3天)、腌蘿卜(腌制4天)：均為自制；維生素C：成都市科龍化工試劑廠。

752型紫外-可見分光光度計(jì) 上海達(dá)平儀器有限公司；PHS-3C型酸度計(jì) 成都銳新儀器有限公司；HH-4S水浴鍋；FA1204B/0.0001 g電子分析天平；高速組織攪拌器。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取不同量的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中構(gòu)成不同亞硝酸鹽濃度，加入4 g/L對(duì)氨基苯磺酸2 mL，搖勻靜止3 min，加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺，加水定容至刻度，靜止15 min。于波長538 nm處測定吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.61289x+0.01271,r=0.99926，線性范圍為0～1.4 μg/mL。

1.3 臘肉、酸菜、腌制蘿卜3種樣品處理

臘肉、酸菜、腌制蘿卜3種樣品搗碎，各取200 g于燒杯中，加水200 mL制成勻漿備用。

1.4 山葵浸提液的制備

山葵根莖洗凈、晾干、搗碎后，取25 g，用300 mL 40%乙醇轉(zhuǎn)入500 mL錐形瓶中，在20 ℃下浸提40 min后用濾紙過濾，將濾液放置在15 ℃黑暗泡沫箱中備用。

1.5 亞硝酸鹽含量的測定

取40 mL制備的樣品于比色管中，以下步驟按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制操作。于波長538 nm處測吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得亞硝酸鹽的含量。

1.6 亞硝酸鹽清除率的測定

準(zhǔn)確吸取5 μg/mL NaNO2溶液2.5 mL,移入50 mL比色管中,加15 mL山葵浸提液,調(diào)pH,搖勻,反應(yīng)15 min后,加2 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸,搖勻,靜置4 min,再加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，搖勻，定容至刻度,靜止15 min，取上清液,于538 nm處測吸光度值。

NaNO2清除率=[A-(B-C)]/A。

式中：A為亞硝酸鈉OD值；B為實(shí)驗(yàn)組OD值；C為山葵浸提液OD值。

1.7 山葵浸提液對(duì)亞硝酸鹽最佳清除條件的探究

通過單因素試驗(yàn)確定山葵浸提液對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響因素,之后選取主要因素,設(shè)置不同水平,通過正交試驗(yàn)確定山葵浸提液對(duì)亞硝酸鹽的最佳清除條件。

1.8 樣品中亞硝酸鹽清除率的測定

分別取2份臘肉、酸菜、腌制蘿卜勻漿，其中1份加入山葵浸提液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為3.2，反應(yīng)30 min，另1份做空白，然后將勻漿全部轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，加入6 mL飽和硼砂溶液，搖勻，再加入30%硫酸鋅溶液2 mL和15%亞鐵氰化鉀溶液2 mL，振搖3 min，定容至刻度，搖勻，靜置，過濾，按1.6操作方法比色，計(jì)算山葵浸提液對(duì)食品中亞硝酸鹽的清除率。

1.9 不同pH反應(yīng)介質(zhì)中Vc對(duì)亞硝酸鹽的消除測定

取1.75 g Vc溶于1000 mL 40%乙醇溶液中，其濃度為1.75 mg/L，取15 mL，與2.5 mL亞硝酸鈉在不同pH介質(zhì)下反應(yīng)，顯色測定，計(jì)算其消除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

設(shè)置反應(yīng)介質(zhì)pH值、山葵浸提液用量、浸提溫度、浸提時(shí)間、反應(yīng)時(shí)間和亞硝酸鹽量6個(gè)因素來研究山葵浸提液清除亞硝酸鹽的影響。

2.1.1 反應(yīng)介質(zhì)pH 值對(duì)亞硝酸鹽清除的影響

分別取5份NaNO2溶液，加入20 ℃下浸提40 min山葵浸提液15 mL，用白醋調(diào)節(jié)反應(yīng)液為不同pH值，分別測定亞硝酸鹽的含量，計(jì)算清除率，見表1。

表1 反應(yīng)介質(zhì)pH值對(duì)亞硝酸鹽清除的影響

由表1可知，在不同pH反應(yīng)介質(zhì)中，隨著pH的增大，山葵浸提液對(duì)亞硝酸鹽的清除率先增大后減小，在pH為3.5的亞硝酸鹽清除率最大，為87.51%，原因是山葵浸提液中對(duì)亞硝酸鹽有清除作用的各物質(zhì)在pH達(dá)到3.5時(shí)綜合清除率達(dá)到最大。

2.1.2 山葵浸提液用量對(duì)亞硝酸鹽清除的影響

分別取15支50 mL容量的比色管，每份加 NaNO2溶液2.5 mL, 加入山葵浸提液0，5，10，15，20 mL，用白醋調(diào)節(jié)pH為3.5，反應(yīng)15 min,通過顯色測定其吸光度，計(jì)算亞硝酸鹽清除率見表2。

表2 山葵浸提液用量對(duì)亞硝酸鹽清除的影響

由表2可知，隨著山葵浸提液用量的增加，在相同時(shí)間下不同試樣中亞硝酸鹽的清除率逐漸增加，但在5～10 mL變化明顯，而之后變化較小。山葵浸提液作為反應(yīng)物其底物濃度增大會(huì)加速化學(xué)反應(yīng)中對(duì)另一種反應(yīng)物亞硝酸鹽的消耗，其理論上亞硝酸鹽清除率會(huì)接近100%。

2.1.3 不同溫度下獲得的山葵浸提液對(duì)亞硝酸鹽清除的影響

山葵浸提液的制備：分別取9份搗碎的山葵根莖每份5 g于250 mL錐形瓶中，加入40%乙醇100 mL在0，5，10，15，20，25，30，35，40 ℃下浸提40 min，過濾后通過顯色測定其吸光度，計(jì)算亞硝酸鹽清除率，見表3。

表3 不同溫度條件下獲得的山葵浸提液對(duì)NaNO2清除的影響

由表3可知，山葵浸提液的浸提過程中，溫度對(duì)亞硝酸鹽的清除影響很大?？傮w趨勢是浸提溫度越高其清除率越低。溫度在0～5 ℃消除率下降明顯，在5～35 ℃消除率變化不大，當(dāng)溫度大于35 ℃后，清除率又明顯降低。原因可能是山葵中對(duì)亞硝酸鹽有清除作用的物質(zhì)不穩(wěn)定，溫度升高導(dǎo)致其被破壞。目前已知山葵浸提液中對(duì)亞硝酸鹽有清除作用的物質(zhì)Vc是不穩(wěn)定物質(zhì)，其對(duì)熱不穩(wěn)定，容易氧化和被熱破壞[10]，溫度越高其浸提率越低[11,12]。另外，山葵中含有異硫氰酸酯類化合物，其揮發(fā)與水解速度隨著溫度升高而加快[13]。

2.1.4 不同浸提時(shí)間的山葵浸提液對(duì)亞硝酸鹽清除的影響

山葵浸提液的制備：分別取7份搗碎的山葵根莖，每份5 g于250 mL錐形瓶中，加入40%乙醇100 mL在20 ℃下浸提10，20，30，40，50，60，70 min，過濾后通過顯色測定其吸光度，計(jì)算亞硝酸鹽清除率見表4。

表4 山葵浸提時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除的影響

由表4可知，山葵浸提液在50 min時(shí)對(duì)亞硝酸鹽的清除率達(dá)到最大，其原因可能是植物浸提的過程分為擴(kuò)散、滲透、溶解幾個(gè)階段[14]。山葵組織細(xì)胞被破碎后相應(yīng)物質(zhì)溶解需要一定的時(shí)間。在浸提時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)清除率達(dá)到最大，山葵中有些清除亞硝酸鹽的物質(zhì)不穩(wěn)定，如:Vc與山葵精油類物質(zhì)均是在溶液中不穩(wěn)定的物質(zhì)，長時(shí)間暴露在光照下和溶于水中被逐漸消耗，從而導(dǎo)致浸提時(shí)間加長，亞硝酸鹽消除率降低。

2.1.5 不同作用時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除的影響

分別取15支50 mL容量的比色管，每份加5 μg/mL NaNO2溶液2.5 mL, 各加入山葵浸提液15 mL，用白醋調(diào)節(jié)pH為3.5,分別反應(yīng)5,10,15,20,25,30 min，通過顯色測定其吸光度，計(jì)算亞硝酸鹽清除率，見表5。

表5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽消除的影響

由表5可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，亞硝酸鹽的清除率增大。其原因是化學(xué)反應(yīng)需要時(shí)間，在反應(yīng)未達(dá)平衡之前反應(yīng)一直正向進(jìn)行，一直消耗反應(yīng)物亞硝酸鹽。在理論情況下會(huì)一直上升，之后逐漸變緩至水平，清除率不會(huì)出現(xiàn)兩邊低中間高的峰值。同時(shí)在15 min后消除率增長變慢，說明前15 min大部分反應(yīng)物已經(jīng)被消耗。

2.1.6 不同亞硝酸鹽量對(duì)亞硝酸鹽清除率與清除量的影響

顯色與測量：實(shí)驗(yàn)組取6支50 mL容量的比色管，每份加 5 μg/mL 亞硝酸鹽溶液1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0 mL, 加入山葵浸提液15 mL,用白醋調(diào)節(jié)pH為3.5，反應(yīng)15 min，通過顯色測定其吸光度，計(jì)算亞硝酸鹽清除率見表6。

表6 亞硝酸鹽量對(duì)亞硝酸鹽清除量和清除率的影響

由表6可知，在山葵液用量不變的情況下，亞硝酸鹽加入量為1 mL時(shí)清除率最大為100%，隨著反應(yīng)物中亞硝酸鹽含量的增加，清除率逐漸降低。而亞硝酸鹽清除量剛好相反，其呈現(xiàn)先增加后逐漸保持不變的狀態(tài)。在加入亞硝酸鹽量達(dá)到3 mL之后，亞硝酸鹽的消除量基本上保持不變，說明15 mL山葵浸提液清除的亞硝酸鹽為13.43 μg。

2.2 山葵浸提液對(duì)亞硝酸鹽最佳清除條件的測定

選取山葵浸提溫度、浸提時(shí)間、反應(yīng)液 pH 值3個(gè)主要因素采用 L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)以確定山葵對(duì)亞硝酸鹽的最佳清除條件。

表7 浸提溫度、提取時(shí)間、pH正交試驗(yàn)

由表7可知，在幾種因素各自的梯度下，因素C(pH)為最重要的因素，因素A(溫度)次之，最后是因素B(提取時(shí)間)。隨機(jī)變量極差為1.14，與提取時(shí)間極差1.87相差不大，說明提取時(shí)間在50 min上下波動(dòng)幅度為5 min時(shí)消除效果已很穩(wěn)定。通過正交試驗(yàn)得出最佳控制條件為：提取溫度0 ℃、提取時(shí)間55 min、反應(yīng)介質(zhì)pH 3.2。

2.3 山葵浸提液清除食品中亞硝酸鹽

2.3.1 山葵浸提液對(duì)臘肉亞硝酸鹽的清除

測得臘肉中亞硝酸鹽含量為35.67 mg/kg,用山葵液處理后測得亞硝酸鹽含量為5.32 mg/kg，清除率為85.09%。

2.3.2 山葵浸提液對(duì)白菜腌制的酸菜中亞硝酸鹽的清除

測得酸菜中亞硝酸鹽含量為58.23 mg/kg,用山葵浸提液處理后測得亞硝酸鹽含量為9.62 mg/kg，清除率為83.48%。

2.3.3 山葵浸提液對(duì)腌制蘿卜中亞硝酸鹽的清除

測得腌制蘿卜中亞硝酸鹽含量為12.25 mg/kg，用山葵浸提液處理后測得亞硝酸鹽含量為0.32 mg/kg,清除率為97.39%。

2.4 Vc對(duì)亞硝酸鹽的清除研究

表8 Vc對(duì)亞硝酸鹽的清除影響

由表8可知， Vc對(duì)亞硝酸鹽有清除作用，其中Vc在不同pH下清除亞硝酸鹽的變化趨勢與山葵在不同pH下清除亞硝酸鹽的變化相似。同時(shí)根據(jù)山葵中成分含量參照已知山葵根莖含有大量Vc，Vc在酸性條件下穩(wěn)定但在堿性條件下不穩(wěn)定，易被分解，Vc的配制濃度也與山葵中Vc濃度相對(duì)應(yīng)，因此山葵浸提液對(duì)亞硝酸鹽的清除作用可能與Vc關(guān)系較大。

3 討論

影響山葵浸提液對(duì)亞硝酸鹽清除的主要因素有pH、山葵浸提溫度、山葵浸提時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行條件優(yōu)化，得出最適反應(yīng)pH為3.2，浸提溫度為0 ℃，浸提時(shí)間為55 min，在一定條件下亞硝酸鹽用量越少，山葵浸提液用量越多，且反應(yīng)時(shí)間越長，消除效率越高，但最終會(huì)達(dá)到最大值，即清除率不再隨著山葵浸提液用量的增加與作用時(shí)間的延長而變化。同時(shí)，將山葵浸提液運(yùn)用到食品中對(duì)亞硝酸鹽的清除，其效果顯著。

由于山葵作為一種植物，其物質(zhì)成分太過復(fù)雜，本研究只能推導(dǎo)降解亞硝酸鹽的物質(zhì)有Vc，并不能準(zhǔn)確給出降解亞硝酸鹽的主導(dǎo)物質(zhì)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)山葵的最佳浸提溫度為0 ℃，而朱鳳妹在《大蒜浸提液清除醬腌菜中亞硝酸鹽的研究》中提到大蒜浸提液的最佳浸提溫度為80 ℃，這2種材料浸提溫度相差很大，說明2種植物材料清除亞硝酸鹽的物質(zhì)必定有較大差異。本實(shí)驗(yàn)對(duì)山葵浸提液清除亞硝酸鹽的條件優(yōu)化中，其最適pH酸性較強(qiáng)，食品運(yùn)用過程中可根據(jù)實(shí)際情況選擇較弱的酸性條件，同時(shí)選用本研究優(yōu)化的其他最適條件也能達(dá)到高效清除亞硝酸鹽的效果。本實(shí)驗(yàn)拓展研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)酸在強(qiáng)酸性環(huán)境下對(duì)亞硝酸鹽有清除作用，如用鹽酸使pH達(dá)到1.5，反應(yīng)時(shí)間為15 min，其清除率達(dá)到8.3%，而pH為0.5時(shí)其清除率達(dá)到35.8%。