星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選“扶正固本”方 最佳提取工藝

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1.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，西藏 拉薩 850000；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

惡性腫瘤是威脅人類(lèi)健康的重大疾病，也是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要原因之一[1]。目前，惡性腫瘤的治療主要包括手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療，其中化療作為一種全身治療方式能夠在局部或全身減輕腫瘤細(xì)胞負(fù)荷[2]。臨床中腫瘤發(fā)生、發(fā)展等同機(jī)體免疫功能密切相關(guān)，腫瘤化療過(guò)程中由于化療藥物體內(nèi)選擇性差，在殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)會(huì)損傷免疫細(xì)胞，嚴(yán)重影響自身免疫系統(tǒng)抗腫瘤機(jī)制出現(xiàn)免疫抑制，對(duì)免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)就可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散[3]。與傳統(tǒng)化療藥物相比，中藥在抗癌方面具有安全高效、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛用于防治惡性腫瘤[4]?！胺稣瘫尽笔侵嗅t(yī)治病的主要治則之一，可以減輕化療藥物所導(dǎo)致的機(jī)體免疫功能損傷。經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究證實(shí)：“扶正固本”法是對(duì)機(jī)體的免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，利于淋巴細(xì)胞的增殖和促進(jìn)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的活力進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力[5]。惡性腫瘤在中醫(yī)學(xué)中稱(chēng)為“積證”、“癭病”等?！夺t(yī)宗必讀》中記載：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”，表明正氣虧虛是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的根本原因。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為扶助正氣，穩(wěn)固本源能夠達(dá)到“正氣存內(nèi)、邪不可侵”的目的[6]。為了充分發(fā)揮中醫(yī)藥在腫瘤治療過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)，研究中選取了由人參、黃芪、茯苓等七味中藥組成的“扶正固本”方。并對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，為其進(jìn)一步研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-3010型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本東芝公司)，Sartorius CP225D型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，B-220恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)，DZF型真空干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)，RE53CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 D(+)無(wú)水葡萄糖(D0806AS，美侖生物)，藥材購(gòu)自安國(guó)藥材市場(chǎng)經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》2015年版一部的規(guī)定，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

“扶正固本”方由人參、黃芪、茯苓、白術(shù)、五味子、澤瀉、炙甘草七味藥組成。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)多糖為扶正固本方的主要活性成分，因此采用水煎煮法提取，實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)試驗(yàn)-效應(yīng)面法，以總多糖含量和出膏率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察提取時(shí)間、提取次數(shù)及加水量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.1 多糖的含量測(cè)定[7]

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品50.00 mg，置50 mL的容量瓶中，加水定容，制成1.00 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.1.2 5%苯酚溶液的制備 精密量取80 ℃熔化的苯酚溶液5 mL，至100 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水至100 mL，搖勻。4℃冷藏，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取處方量藥材，按照設(shè)計(jì)方案加水提取，絹布過(guò)濾，定容到600 mL。取定容液5 mL，3500 r離心5 min，取上清1 mL，加95%乙醇5 mL，混勻靜置4 h，3500 r離心15 min，沉淀加10 mL水溶解，取1 mL加水定容至5 mL即得供試品溶液。精密量取供試品溶液2 mL，加5%苯酚溶液1 mL 搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸振搖5 min，90 ℃加熱15 min，室溫冷卻30 min，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2、2.5 mL分別置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。制備濃度分別為0.0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。精密量取上述各溶液2 mL，加5%苯酚溶液1 mL搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸振搖5 min，90 ℃加熱15 min，室溫冷卻30 min，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。經(jīng)計(jì)算得線(xiàn)性回歸方程為，y=20.563x+0.2071(r=0.9992，n=6)無(wú)水葡萄糖在0.0～0.05 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液按照“2.1.4”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法，連續(xù)測(cè)定5次。結(jié)果顯示葡萄糖溶液吸光度值的RSD=0.075%(n=5)。表明儀器的精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，平行操作6份，按照“2.1.4”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度值，結(jié)果顯示吸光度值的RSD=0.105%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h后，“2.1.4”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度值。結(jié)果吸光度值的RSD=0.097%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率 精密稱(chēng)取供試品溶液5 mL，分別加入質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL的對(duì)照品溶液適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.1.4”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸光度值。計(jì)算加樣回收率=97.26±0.45%。

2.2 出膏率測(cè)定 精密量取提取液75 mL置蒸發(fā)皿中，80℃水浴蒸干，干燥箱105℃干燥至恒重，室溫下置干燥器中冷卻30 min，精密稱(chēng)定重量，計(jì)算干浸膏得率。

2.3 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 因素水平表選擇 提取時(shí)間(A)、提取次數(shù)(B)以及加水量(C)3個(gè)因素作為本研究的考察對(duì)象，并確定其用量范圍為：A：1～2，B：1～3，C：8～12。采用效應(yīng)面法可連續(xù)的對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析。以出膏率(Y1)、含糖量(Y2)、綜合評(píng)分(Y3)作為測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考察。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表 1 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼

2.3.2星點(diǎn)方案及結(jié)果 實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果

注：*P<0.05模型或考察因素有顯著影響；**P<0.01模型或考察因素有極顯著影響；NS>0.05。

2.3.3 擬合模型的建立 采用Design-Expert 8.0.6.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理，以綜合評(píng)分Y3為因變量，得二次多項(xiàng)式擬合方程。Y3=-1.98097+0.095825A+0.31370B+0.39804C+0.075850AB-0.00175AC-0.0082625BC-0.057200A2-0.034525B2-0.018237C2(r=0.9728，P<0.01)對(duì)上述擬合模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀泻芨叩娘@著性(P<0.01)。其中一次項(xiàng)B對(duì)Y3影響顯著(P<0.01)，二次項(xiàng)中C2對(duì)Y3有顯著影響(P<0.05)；一次項(xiàng)A、C，二次項(xiàng)A2、B2及交互項(xiàng)對(duì)Y3的影響不顯著(P>0.05)。r=0.9728，說(shuō)明模型能夠很好地反映響應(yīng)值的變化，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)扶正固本方的最佳提取工藝。

2.3.4 響應(yīng)面結(jié)果分析及最佳處方的確定 利用Design-Expert V8.0.6.1軟件，當(dāng)將1個(gè)因素的編碼值設(shè)定為0時(shí)，另外2個(gè)因素與響應(yīng)值包封率的三維響應(yīng)面圖自動(dòng)生成，結(jié)果如圖2所示。在等高線(xiàn)圖中，圓心的位置為極值條件出現(xiàn)的位置，等高線(xiàn)圖越趨近于圓形，越說(shuō)明此時(shí)的兩個(gè)因素之間的相互作用對(duì)包封率的影響越大。越接近圓心位置，其綜合評(píng)分的值越大。圖2清晰的表明了B對(duì)包封率的影響最大。等高線(xiàn)圖越扁平，表示因素之間的相互影響越小，A、C兩因素之間的影響最小。在規(guī)定的提取時(shí)間、次數(shù)、加水量的范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)最佳處方為提取時(shí)間2 h，加10倍量水，提取3次。

2.3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)效應(yīng)面法優(yōu)選出的結(jié)果制備3批供試品，并對(duì)3批樣品的多糖含量及出膏率進(jìn)行測(cè)定。表4結(jié)果顯示，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選出的提取方法提取，綜合評(píng)分Y3=0.8751%，將最優(yōu)處方代入擬合方程得出Y3=0.9415，真實(shí)值與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明此方法可行。

表 4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

3 討論

扶正固本方由人參、黃芪、茯苓、白術(shù)、五味子、澤瀉、炙甘草七味藥組成。以人參為君，大補(bǔ)元?dú)?。臣以黃芪入脾經(jīng)而補(bǔ)中氣，固表氣，炙甘草補(bǔ)脾和中，三藥相配可大補(bǔ)一身之氣；五味子酸溫收斂，入腎而滋腎水，固下焦，收耗散之氣，配人參一補(bǔ)一斂，益氣養(yǎng)陰，補(bǔ)斂合法；佐以澤瀉利濕泄?jié)?，濁得以泄，清得以存；脾胃氣虛，運(yùn)化失常，故佐以白術(shù)健脾燥濕，既助參芪補(bǔ)脾胃之氣，又增強(qiáng)脾之運(yùn)化，以助后天生化之源，更以其苦燥之性，燥濕以利健脾；脾主運(yùn)化水濕，脾胃既虛，則濕濁易于停滯，故佐以茯苓，其味甘以健脾，淡以滲濕，使邪去而正氣得復(fù)。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法一種新型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體，具有試驗(yàn)次數(shù)少、試驗(yàn)精度高、可連續(xù)對(duì)實(shí)驗(yàn)各水平進(jìn)行分析等特點(diǎn)[8]。研究采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，通過(guò)二項(xiàng)式擬合描繪了三維響應(yīng)面，所得二項(xiàng)式復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.9728，表明采用此法優(yōu)化扶正固本方提取工藝確實(shí)可行。通過(guò)響應(yīng)面效果圖可清晰了解影響提取效果的3個(gè)因素的效應(yīng)趨勢(shì)。從效果圖可見(jiàn)，影響提取效果的各因素關(guān)系是：提取次數(shù)>提取時(shí)間>加水量?？紤]到實(shí)驗(yàn)的可行性，結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果將提取工藝確定為提取時(shí)間2 h，加10倍量水，提取3次。