鼠尾草酸對大鼠大腦中動脈阻斷引起的 局灶性腦缺血的保護作用

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1.昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500； 2.昆明醫(yī)科大學實驗動物學部，云南 昆明 650500；3.昆明醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程中心，云南 昆明 650500

“腦卒中”(cerebral stroke)又稱“中風”、“腦血管意外”，屬于急性腦血管疾病，是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞導致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一組疾病，包括缺血性和出血性卒中。腦缺血具有發(fā)病率高、病死率高和致殘率高等特點[1 -2]。腦缺血的發(fā)生將會導致興奮性氨基酸毒性[3]、氧化應(yīng)激[4]、炎癥反應(yīng)[5]、DNA 損傷等一系列病理生理過程，最終導致神經(jīng)元損傷以及凋亡[6]。鑒于大鼠腦血管特征與人比較相似[7]，在進行腦缺血相關(guān)疾病研究時往往采用的實驗動物模型是大鼠大腦中動脈阻塞模型[8]，其制備方法較多有線栓法、開顱法、光化學誘導血栓法等。本實驗采用改良線栓法，具有出血少，模型穩(wěn)定，成活率高等特點[9]。

近年來，尋找對腦缺血再灌注損傷有良好治療作用的多靶點藥物的研究是當前研究的熱點，已知具有多靶點作用優(yōu)勢的傳統(tǒng)中藥迷迭香(Rosmarinus officinalis Linn.) 是一種具有豐富使用價值的植物，含有大量的抗氧化成分，其中，迷迭香的主要成分鼠尾草酸(Carnosic acid，CA)是一種天然的植物酚類物質(zhì)[10]，具有抗微生物[11- 12]、抗氧化[13- 14]、抗腫瘤[15]、抗炎[16]、神經(jīng)保護[17]以及保護肝臟[18- 19]等作用。在課題組前期研究中[20]，發(fā)現(xiàn)迷迭香脂溶性提取物對大鼠大腦中動脈局灶性缺血有較好的保護作用，本實驗采用大鼠大腦中動脈阻塞模型，觀察鼠尾草酸預(yù)處理對大鼠大腦中動脈阻斷引起的局灶性腦缺血的保護作用，以期為治療腦卒中提供理論依據(jù)和思路參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 鼠尾草酸(批號：BCSW180530-1，西安百川生物科技有限公司)，燈盞花素片(批號:161101，昆明全新生物制藥有限公司)、尼莫地平片(批號：170201，亞寶藥業(yè)集團股份有限公司)臨用時加入0.5%的羧甲基纖維素鈉研磨配成混懸劑。

1.2 動物 SPF級健康SD雄性大鼠，體重(200±20)g，購于昆明醫(yī)科大學實驗動物學部，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滇)K2015-0002，置于普通環(huán)境，飼養(yǎng)一周左右。

1.3 試劑 PBS緩沖液(批號:11310227，solarbio)、多聚甲醛(批號：20130416，廣州光華科技股份有限公司)、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC，批號：409E033，北京西濃科技有限公司)、凝血酶原時間測定液體試劑盒(批號：STY20101-3B，泰州中勤世帝生物科技有限公司)、活化部分凝血活酶時間測定試劑盒(批號：STY20201-3)、凝血酶時間測定液體試劑盒(批號：STY20301-5)、纖維蛋白原含量測定液體試劑盒(批號：STY20401-5)均為泰州中勤世帝生物科技有限公司。

1.4 儀器 離心機(Thermo Fisher)、冰凍切片機(Leica)、37°恒溫箱(BINDER)、半自動血小板聚集儀(北京世帝科學儀器有限責任公司)、血常規(guī)分析儀(日本希森美康sysmex XT-2000i)。

1.5 方法

1.5.1 動物分組 將健康SD大鼠隨機分為7組，每組6只。假手術(shù)組、模型組給予同體積的溶劑，尼莫地平10 mg/kg組、燈盞花素40 mg/kg組、鼠尾草酸180 mg/kg組、鼠尾草酸90 mg/kg組、鼠尾草酸45 mg/kg組，連續(xù)灌胃7 d，于末次給藥30 min后，采用改良線栓法制備大鼠MCAO模型。

1.5.2 MCAO模型制備[21-23]術(shù)前12 h禁食(不禁水)。稱重后腹腔注射3.6%水合氯醛進行麻醉。暴露頸部備皮，依次用碘伏，酒精消毒。用手術(shù)刀沿頸部的正中線偏右2 mm切一條1.5 cm左右的切口，暴露頜下腺，頓性分離右側(cè)胸鎖乳突肌肌肉與胸骨舌骨肌，此時用自制拉鉤將其向兩側(cè)牽引，充分暴露頸總動脈(Common Carotid Artery CCA)，游離出CCA后，分別在兩端懸掛2根3-0絲線，結(jié)扎近心端，遠心端系活結(jié)以不出血為度。顯微鑷挑起近心端絲線繃直CCA，在距CCA分叉4 mm處將針頭斜方向刺入，輕輕退出針頭，隨即緩慢插入線栓，進線深度控制在(17±0.5)mm，送入頸內(nèi)動脈后結(jié)扎遠心端并固定線栓，剪去多余的線栓及絲線，撤去拉鉤，消毒，縫合皮膚。假手術(shù)組只插入線栓，不阻斷大腦中動脈。

1.5.3 Zealonga評分[24]分別于術(shù)后6、12、24 h參照Zea-Longa 5分制評分標準評分：無神經(jīng)損傷癥狀為0分；大鼠前肢患側(cè)對側(cè)呈屈曲為1分；大鼠自發(fā)行走時向患側(cè)對側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；大鼠身體向患側(cè)對側(cè)傾倒為3分；大鼠喪失意識無法自發(fā)行走為4分。評分越高提示神經(jīng)功能損傷越嚴重。

1.5.4 PRP、PPP制備方法 各組動物于24 h后腹腔注射3.6%水合氯醛(1 mL/100 g)麻醉，開胸暴露心臟，取全血加入3.28 %枸櫞酸鈉(9∶1)抗凝，顛倒混勻，800 r/min，離心12 min,收集上層，即PRP，再以2500 r/min，離心10 min，收集上清即PPP。

1.5.5 ADP誘導血小板聚集率測定 ADP粉末購置于泰州中勤世帝生物科技有限公司，按試劑說明書操作。

1.5.6 血漿制備方法 另取一份全血加入3.28%枸櫞酸鈉(9∶1)抗凝，顛倒混勻，3000 r/min，離心10 min，收集上層清液，即為血漿。

1.5.7 血漿TT、PT、APTT、FIB的測定 檢測試劑盒購置于泰州中勤世帝生物科技有限公司，按試劑盒說明書操作。

1.5.8 TTC染色 大鼠麻醉，迅速開胸暴露心臟，灌注生理鹽水，迅速開顱取腦，去除嗅球、小腦以及低位腦干，于-20 ℃冷凍切片機中速凍7 min，沿冠狀位將鼠腦切開成5片，每片厚度約2 mm。置于1% TTC磷酸鹽緩沖液中37℃避光孵育，每隔10 min翻一面，30 min后吸凈TTC，用4 %多聚甲醛固定24 h后拍照，用Image J測定腦梗死面積，計算梗死面積百分比。

2 結(jié)果

2.1 Zealonga評分 術(shù)后6、12、24 h 對實驗大鼠進行Zealonga評分，結(jié)果顯示各組大鼠神經(jīng)功能損傷表現(xiàn)出一定的差異，與假手術(shù)組相比，模型組出現(xiàn)顯著的神經(jīng)功能損傷，提示建模成功。術(shù)后24 h，鼠尾草酸90 mg/kg組與模型組相比，明顯改善大鼠神經(jīng)功能損傷，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；鼠尾草酸180 mg/kg組能改善大鼠神經(jīng)功能損傷，效果與尼莫地平組、燈盞花素組相當，甚至更優(yōu)，結(jié)果見表1。

組別劑量/mg/kg 行為學評分/分 6h12h24h假手術(shù)0.00±0.000.00±0.000.00±0.00模型1.80±0.45△△2.60±0.55△△3.60±0.55△△尼莫地平101.80±0.452.00±0.002.92±1.02燈盞花素402.00±0.002.20±0.453.00±0.58鼠尾草酸1801.80±0.452.20±0.452.50±0.50鼠尾草酸902.00±0.002.00±0.002.25±0.43?鼠尾草酸451.80±0.452.60±0.553.00±0.00

注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

2.2 血小板聚集率、TT、PT、APTT、FIB測定結(jié)果 與假手術(shù)組相比，各組大鼠血小板聚集率有上升的趨勢，纖維蛋白原含量(FIB)明顯升高，凝血酶原時間(Prothrombin Time, PT)、凝血酶時間(Thrombin Time，TT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)均有下降趨勢。與模型組比較，鼠尾草酸180 mg/kg組能明顯降低ADP誘導的血小板聚集率，延長APTT，顯著性降低FIB含量；鼠尾草酸90 mg/kg組能有效延長APTT，明顯降低FIB含量；鼠尾草酸45mg/kg組能顯著性降低FIB；尼莫地平組能顯著性降低FIB含量；燈盞花素組能明顯延長APTT，明顯降低FIB含量，結(jié)果見表2。

組別劑量/mg/kg血小板聚集率/%TT/sPT/sAPTT/sFIB/g·L-1假手術(shù)0.27±0.0328.00±3.3112.88±1.4726.07±3.912.85±0.25模型0.30±0.0527.87±3.1011.95±1.5120.05±2.973.26±0.43△尼莫地平100.30±0.0527.55±3.6612.27±1.4326.70±5.202.67±0.33??燈盞花素400.30±0.0529.13±3.6111.68±1.2528.03±2.93?2.81±0.36?鼠尾草酸1800.24±0.02?30.72±2.7411.72±2.1931.50±5.10?2.61±0.26??鼠尾草酸900.26±0.0628.30±3.4010.42±0.7840.70±3.90?2.85±0.43?鼠尾草酸450.25±0.0430.75±3.8212.63±2.0934.30±9.912.32±0.13??

注：與假手術(shù)組比較，△P<0.05；與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

2.3 腦梗死面積檢測結(jié)果

2.3.1 TTC染色結(jié)果 與模型組比較，假手術(shù)組冠狀切面未見明顯梗死區(qū)域，實驗組大鼠大多數(shù)可見皮質(zhì)部有較多的梗死區(qū)(白色)，與非梗死區(qū)(紅色)界線較明顯，結(jié)果如圖1所示。

2.3.2 梗死面積百分比 與模型組相比，鼠尾草酸180 mg/kg組、鼠尾草酸90 mg/kg組和尼莫地平組大鼠的腦梗死面積百分比明顯縮小，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如圖2所示。

2.4 血常規(guī)檢測結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組中性細胞比率、網(wǎng)織紅細胞數(shù)、高熒光網(wǎng)織紅比率明顯升高，白細胞明顯下降；與模型組比較，尼莫地平組中性細胞數(shù)、單核細胞明顯下降；燈盞花素組單核細胞比率、單核細胞顯著降低；鼠尾草酸180 mg/kg組白細胞、血小板、中性細胞數(shù)、單核細胞明顯升高，血紅蛋白、平均血小板體積、平均血紅蛋白量、平均血紅蛋白濃度、中性細胞比率明顯下降；鼠尾草酸90 mg/kg組血小板、血小板壓積、嗜堿性粒細胞、低熒光網(wǎng)織紅比率升高，紅細胞平均體積、淋巴細胞比率、嗜酸性粒細胞、高熒光網(wǎng)織紅比率、未成熟網(wǎng)織紅細胞分數(shù)明顯降低；鼠尾草酸45 mg/kg組白細胞、淋巴細胞數(shù)、單核細胞、中熒光網(wǎng)織紅細胞比率明顯升高，平均血小板體積、淋巴細胞比率、紅細胞分布寬度、血小板分布寬度、大型血小板比率明顯下降，其他指標無明顯改變，結(jié)果見表3。

測定項目假手術(shù)模型尼莫地平10mg/kg燈盞花素40mg/kg鼠尾草酸180mg/kg鼠尾草酸90mg/kg鼠尾草酸45mg/kg白細胞(×109/L)5.38±0.693.95±0.83△3.60±0.733.73±1.006.86±2.07??4.35±0.496.46±1.11??紅細胞9.35±0.739.66±1.529.32±0.919.01±1.649.17±0.1510.35±0.468.45±0.50血紅蛋白(g/L)172.17±20.88183.33±27.36167.50±21.62158.33±28.26147.20±20.80??193.50±21.60160.00±10.41紅細胞壓積(%)53.10±3.1453.73±4.8554.86±5.1753.45±4.9955.31±2.7958.30±1.5050.13±4.23血小板( ×109/L)919.50±85.53810.00±88.12816.08±73.61788.17±109.78958.00±133.91?927.50±77.91?783.50±79.92平均血小板體積(fL)7.58±0.207.80±0.247.73±0.387.83±0.367.02±0.26??7.70±0.157.13±0.13??血小板壓積0.70±0.080.63±0.060.64±0.060.62±0.070.67±0.080.72±0.07?0.56±0.05紅細胞平均體積(fL)56.92±3.0959.13±1.9458.87±1.5958.72±3.0659.18±1.5056.43±2.00?59.28±2.02平均血紅蛋白量(pg)17.97±1.4720.27±1.9418.08±2.6418.62±3.4816.08±2.44??18.80±2.4819.03±1.69平均血紅蛋白濃度(g/L)323.83±26.74343.33±22.32307.50±45.77333.67±42.05271.40±38.14??332.25±37.70322.75±39.51中性細胞比率(%)31.38±6.2443.53±7.46△△37.31±2.9046.20±10.5732.88±5.65?41.45±8.2542.42±6.09淋巴細胞比率(%)63.50±10.1462.68±10.6656.07±9.1252.46±10.9454.33±7.3347.55±8.18??46.02±8.10??單核細胞比率(%)6.92±1.638.70±1.948.32±1.586.21±0.69?10.63±3.038.78±1.119.10±3.38嗜酸性粒細胞比率(%)0.85±0.470.77±0.590.73±0.560.32±0.200.22±0.130.00±0.000.45±0.32中性細胞數(shù)(×109/L)1.84±0.601.94±0.451.36±0.33?1.74±0.422.45±0.29?1.59±0.212.15±0.31淋巴細胞數(shù)(×109/L)3.20±0.172.54±0.402.06±0.322.16±0.552.89±0.532.06±0.383.30±1.20?單核細胞0.37±0.090.40±0.030.26±0.09?0.20±0.06??0.88±0.18??0.45±0.130.68±0.12?嗜酸性粒細胞0.02±0.010.01±0.010.02±0.010.01±0.010.02±0.010.00±0.00?0.03±0.02嗜堿性粒細胞0.00±0.000.40±0.630.50±0.840.30±0.390.40±0.490.75±0.390.25± 0.39

續(xù)表3

測定項目假手術(shù)模型尼莫地平10mg/kg燈盞花素40mg/kg鼠尾草酸180mg/kg鼠尾草酸90mg/kg鼠尾草酸45mg/kg紅細胞分布寬度(%)31.08±2.3431.23±1.8331.72±1.7830.33±1.2430.12±0.9830.80±1.3228.98±0.76?RDW-CV18.17±1.9616.70±1.9617.72±1.7716.72±2.1717.44±0.3819.33±0.5315.35±0.58血小板分布寬度(fL)8.65±0.268.82±0.518.65±0.598.73±0.667.72±0.40?8.95±0.387.70±0.14?大型血小板比率(%)8.25±1.199.82±1.679.42±2.4210.12±2.416.12±1.59??9.58±1.106.63±0.73??網(wǎng)織紅細胞數(shù)0.21±0.050.2600±0.04△0.26±0.050.23±0.040.19±0.02?0.25±0.030.26±0.06中熒光網(wǎng)織紅細胞比率16.98±2.4419.50±2.7517.50±3.2718.87±2.7816.78±2.7615.27±2.67?22.35±2.70高熒光網(wǎng)織紅比率11.49±1.2318.73±3.74△17.62±6.2413.06±4.8817.12±2.208.49±1.01?23.72±5.10網(wǎng)織紅細胞百分比2.2700±0.45002.8500±0.54002.8500±0.54002.6500±0.64002.1100±0.16002.5700±0.25002.7600±0.3000低熒光網(wǎng)織紅比率71.30±5.6464.32±7.6665.98±8.2672.97±9.9266.10±4.8979.35±5.78??56.68±11.58未成熟網(wǎng)織紅細胞分數(shù)28.70±5.6437.20±7.6934.02±8.2630.63±6.4633.90±4.8920.65±5.78??43.33±11.58

注：與假手術(shù)組比較，△P<0.05,△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

目前我國每年新發(fā)腦血管病患者約270萬，死于腦血管病的患者約130萬，腦卒中已成為中國居民第一位死因，嚴重威脅人類健康、影響生活質(zhì)量，是現(xiàn)代社會致死和致殘率極高的疾病。當大腦發(fā)生局部急性腦缺血時，會引起缺血中心區(qū)域梗死，而梗死周圍區(qū)域又稱為缺血半影區(qū)，該區(qū)域損傷可逆。因此，對于腦缺血的治療主要著手于恢復(fù)血供和保護半影區(qū)神經(jīng)元[25]。目前，臨床上用于治療腦缺血的方法有抗氧化、溶栓、降顱壓、抗血小板聚集等[26]。天然抗氧化劑鼠尾草酸為唇形科迷迭香屬植物迷迭香的主要活性成分，具有抑制血小板聚集[27]、保護H2O2損傷的神經(jīng)元[10]、抗氧化[28]、誘導肝癌細胞凋亡[15]、預(yù)防葡聚糖硫酸鈉誘導的急性腸炎[29]等作用。

局灶性腦缺血后，大鼠神經(jīng)功能評分和TTC染色結(jié)果顯示，鼠尾草酸預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能損傷得到明顯改善，能明顯縮小腦梗死面積百分比，對腦缺血損傷表現(xiàn)出一定的保護作用。此外，鼠尾草酸還能夠抑制血小板聚集，延長ATPP，降低纖維蛋白原(FIB)含量，進而影響大鼠血常規(guī)生理指標。

綜上所述，鼠尾草酸對腦缺血疾病有一定的保護作用，本項目的開展，為腦缺血再灌注損傷的治療提供一種新型多靶點藥物，有望為云南特色豐產(chǎn)植物迷迭香治療腦卒中提供了理論基礎(chǔ)和開辟了新思路，為預(yù)防和治療心腦血管疾病提供新藥候選，具有重要的科學價值和現(xiàn)實意義。