表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對血液胰島素和胰高血糖素的影響

黃業(yè)偉，高 晨，顏 平，張 蒙，張冬英，吳曉云

(1.云南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學普洱茶學教育部重點實驗室，云南 昆明 650201；3.云南省茶深加工工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650201)

【研究意義】胰島素(INS)發(fā)展至今已有近百年的歷史，胰島素治療是目前公認的最有效的糖尿病核心療法，它是降血糖的唯一激素[1-2]。糖尿病患者經(jīng)過有效安全的胰島素治療后，血糖可以長期達標，糖尿病并發(fā)癥發(fā)病幾率顯著降低，這對提高患者生活質(zhì)量與延長壽命具有至關(guān)重要的作用[3-5]。但是，現(xiàn)在許多糖尿病患者不良的飲食和生活習慣導致血糖水平控制不佳，影響胰島素藥物治療效果，甚至引起糖尿病并發(fā)癥的產(chǎn)生。而對于有喝茶習慣的糖尿病病人，喝完茶后是否會影響血液中胰島素水平，從而減弱胰島素治療效果，目前還沒有確切的結(jié)論。【前人研究進展】黃業(yè)偉等研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚和兒茶素類物質(zhì)具有多個酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物，易與疏水性物質(zhì)結(jié)合，例如咖啡因、脂類等[6]。王素敏等研究發(fā)現(xiàn)氧化型茶多酚能與體內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合，抑制腸道對其吸收，增加糞便脂類的排出[7]。Shan等在以SD大鼠為對象研究發(fā)現(xiàn)，普洱茶中的主要茶多酚物質(zhì)——氧化型茶多酚可以與阿替洛爾結(jié)合形成復合物，從而抑制機體對阿替洛爾的吸收，并促進其從糞便中排出，進而影響藥物的治療效果[8]。盧浩等曾用普洱茶中的氧化型茶多酚對食用黃曲霉毒素飲食的SD大鼠進行長期治療后，氧化型茶多酚能夠與黃曲霉毒素B1結(jié)合形成復合物，從而抑制黃曲霉毒素B1的吸收，進而抑制其對肝臟的毒性[9]?！颈狙芯壳腥朦c】EGCG作為茶葉中兒茶素的主要成分，也具有多個酚羥基結(jié)構(gòu)，表明EGCG也易與疏水物質(zhì)結(jié)合；胰島素蛋白的表面具有疏水性位點，其與EGCG之間是否會發(fā)生相互作用，從而阻礙血液中胰島素發(fā)揮藥效，此方面研究報道甚少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究EGCG是否會影響血液中胰島素和胰高血糖素的檢測，以及飲用茶是否會影響糖尿病病人血液中的胰島素和胰高血糖素水平，對于有飲茶習慣的糖尿病人具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG，純度>98 %，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)；鏈脲佐菌素(美國，Sigma)；一水合檸檬酸(分析純，天津市大茂化學試劑廠)；檸檬酸鈉酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；肝素鈉(上海，北京鼎國生物科技有限責任公司)；抑肽酶(上海，bovinelung，上海邦景實業(yè)有限公司)；胰島素試劑盒(美國，Crystal chem)；胰高血糖素試劑盒(美國，Crystal chem)。

1.2 主要儀器

Multiskan Mk3型酶標儀(Thermo，美國)；SK-18TC型超聲波清洗儀(上?？茖С晝x器有限公司，中國)；超純水機(普力菲爾理化檢測型)；血糖儀(三諾，中國)；磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；電子天平(北京多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；小型臺式高速離心機(HITACHI，日本)；4 ℃生物藥品柜(海爾，中國)；掌上離心機(TOMY公司，日本)；-80 ℃超低溫冰箱(海爾，中國)；移液槍 (吉爾森、Eppendorf)；制冰機(三洋電機，中國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑盒檢測方法 從4 ℃冰箱取出胰島素(型號90080，美國Crystal chem)和胰高血糖試劑盒(型號81504，美國Crystal chem)，于室溫平衡30 min。胰島素試劑盒使用方法：配制胰島素標準品，向96孔板中加入5 μl的樣品和標品后再向每孔加入95 μl的樣品稀釋液，貼膜4 ℃孵育2 h，洗板6次后加入100 μl酶共軛稀釋劑后室溫孵育1 h。最后洗板6次，加入100 μl顯色液TMB 30 min后終止反應，利用酶標儀測450 nm和630 nm的吸光度值。

胰高血糖素試劑盒使用方法：配制胰高血糖素標準品，向96孔板中加入50 μl的樣品和標品后再向每孔加入50 μl的標記抗原，貼膜4 ℃孵育44～48 h，洗板3次后加入SA-HRP溶液，貼膜，搖床上室溫孵育1 h，洗板3次加入100 μl顯色液OPD Tablet 20 min后終止反應，利用酶標儀測490和630 nm的吸光度值。

1.3.2 EGCG對胰島素和胰高血糖素含量測定的影響 在體外實驗中，向裝有正常大鼠血液的離心管中分別加入胰島素與胰高血糖素，隨后分別加入不同濃度的EGCG。EGCG對胰島素含量的測定有6個處理，處理1：EGCG 2 mg/mL +胰島素20 ng/mL、處理2：EGCG 1 mg/mL +胰島素20 ng/mL、處理3：EGCG 0.5 mg/mL +胰島素20 ng/mL、 處理4：EGCG 0.25 mg/mL +胰島素20 ng/mL、 處理5：EGCG 0.125 mg/mL +胰島素20 ng/mL、處理6：胰島素20 ng/mL。分別與胰高血糖素2000 pg/mL在相同時間內(nèi)混勻通過高速離心相互作用，最后用胰島素試劑盒和胰高血糖素試劑盒進行含量的測定。

1.3.3 STZ糖尿病SD大鼠模型建立 將SD大鼠隨機分組，動物飼養(yǎng)于云南農(nóng)業(yè)大學動物實驗中心標準大鼠飼養(yǎng)室，動物自由進食、飲水，開始實驗前動物適應環(huán)境2周。造模前動物禁食12～16 h，次日早上測空腹體重，空腹血糖。提前制備檸檬酸緩沖液，稱取鏈脲佐菌素STZ，并將其溶于檸檬酸緩沖液中。注射時用檸檬酸緩沖液以1 % 的濃度溶解STZ，0.22 μm濾膜過濾消毒。按空腹體重55 mg/kg腹腔注射相應的鏈脲佐菌素(STZ)，在30 min內(nèi)注射完畢[10]。連續(xù)注射3～5 d，監(jiān)測血糖情況，空腹血糖濃度高于11.6 mmol/L 視為建模成功。

1.3.4 EGCG對STZ糖尿病SD大鼠的影響 將建模完成的糖尿病大鼠隨機分成4組：EGCG+INS聯(lián)用組、INS組、EGCG組及對照組，稱重。EGCG+INS聯(lián)用組、EGCG組按100 mg/kg體重灌胃EGCG，其他組灌胃相應體積的生理鹽水，15 min后EGCG+INS聯(lián)用組、INS組皮下注射胰島素1 U/kg體重，其他組皮下注射相應體積的生理鹽水。每隔30 min(持續(xù)到120 min)對大鼠進行眼底靜脈叢采血1 mL，注入加入抑肽酶10 μl的采血管中，離心制備血漿。取相應的血漿，利用試劑盒對血液中的胰島素和胰高血糖素水平進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Excel軟件，利用4-PL分析計算出胰高血糖素、胰島素的含量。利用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

圖1 EGCG對胰島素含量檢測的影響Fig.1 Effect of EGCG on the detection of insulin

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對胰島素和胰高血糖素檢測的影響

2.1.1 EGCG對胰島素含量檢測的影響 胰島素作為一個重要的激素，對人體血糖具有調(diào)節(jié)作用。通過體外實驗研究EGCG對胰島素檢測的影響。如圖1所示，血液中不同濃度EGCG(濃度范圍為0～2 mg/mL)與胰島素混合后，所有EGCG處理組(處理1～5)與單獨胰島素組(CK)相比，沒有顯著性差異，這說明EGCG不會干擾胰島素水平的檢測。

2.1.2 EGCG對胰高血糖素含量檢測的影響 如圖2所示，血液中不同濃度EGCG(濃度范圍為0～2 mg/mL)與胰島素混合后，結(jié)果顯示，低濃度的EGCG組(處理3～5)與胰高血糖素組(CK)之間胰高血糖素含量沒有顯著差異，而高濃度的EGCG組(處理1～2)中胰高血糖素含量要比胰高血糖素組(CK)顯著升高。這表明高濃度的EGCG會影響對胰高血糖素的檢測，為了保證血液中胰高血糖素檢測的準確性，后續(xù)試驗中血液EGCG的濃度不得高于1 mg/mL。

與CK相比，*為P<0.05Compared with the control group, * means P<0.05圖2 EGCG對胰高血糖素含量檢測的影響Fig.2 Effect of EGCG on the detection of exogenous glucagon

與對照組比較，* 表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001Compared with the control group, * means P<0.05, ** means P<0.01, *** means P<0.001圖3 糖尿病模型大鼠血糖變化Fig.3 Changes of blood glucose in diabetic rats

2.2 糖尿病大鼠的血糖及體征變化

SD大鼠作為實驗動物模型，用鏈脲佐菌素(STZ)誘導成胰島素缺乏型的糖尿病動物模型。糖尿病動物模型成功的判斷標準是隨機血糖大于11.6 mmol/L[11]。圖3顯示STZ建模組在注射后第3天的時候，血糖開始逐漸上升，到第9天血糖值已達標準，這說明已經(jīng)建模成功。同時發(fā)現(xiàn)這些建模成功的大鼠體重明顯減少，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿的癥狀。

2.3 EGCG對STZ糖尿病大鼠的血糖影響

將EGCG 100 mg/kg (相當于血液中濃度低于1 mg/mL)的劑量給糖尿病鼠灌胃(模擬糖尿病病人飲用茶)，以15 min/次灌胃持續(xù)120 min，測定血糖。結(jié)果如圖4所示，胰島素組與對照組相比，EGCG組與胰島素組相比，聯(lián)用組與對照組相比，EGCG組與聯(lián)用組相比，各個時間點血糖水平差異極顯著。而EGCG組與對照組相比，血液中的血糖并沒有顯著改變；EGCG+INS聯(lián)用組與INS組相比，在各個時間點上降血糖效果差別不顯著。以上結(jié)果表明，EGCG灌胃糖尿病大鼠，不影響胰島素注射對機體的影響，對機體無降血糖作用。

對照組與胰島素組比較，&表示P<0.05，&&表示P<0.01，&&&表示P<0.001；EGCG組與胰島素組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001；對照組與聯(lián)用組比較，$表示P<0.05，$$表示P<0.01，$$$表示P<0.001；EGCG組與聯(lián)用組比較，^表示P<0.05， ^^表示P<0.01，^^^表示P<0.001。圖4 EGCG對糖尿病大鼠血糖的影響Fig.4 Effect of EGCG on blood glucose in diabetic rats

對照組與胰島素組比較，&表示P<0.05，&&表示P<0.01，&&&表示P<0.001；EGCG組與胰島素組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001；對照組與聯(lián)用組比較，$表示P<0.05，$$表示P<0.01，$$$表示P<0.001；EGCG組與聯(lián)用組比較，^表示P<0.05， ^^表示P<0.01，^^^表示P<0.001。圖5 EGCG對血液胰島素含量的影響Fig.5 Effect of EGCG on serum insulin content

2.4 EGCG對STZ糖尿病大鼠血液激素水平的影響

2.4.1 EGCG對血液中胰島素含量的影響 胰島素和胰島素受體結(jié)合，激活胰島素下游信號通路，促進糖原合成及全身組織對葡萄糖的攝取和利用，并抑制糖原的分解和糖原異生，從而起到降血糖作用[12]。如圖5所示，對血液中胰島素含量進行檢測，EGCG組與對照組比較沒有顯著性的差異。由于EGCG+INS聯(lián)用組與INS組中有外源的胰島素注入，所以血液中胰島素含量比較高；而EGCG+INS聯(lián)用組與INS組相比，在各個時間點都沒有顯著差異，這表明EGCG干預不會引起血液中胰島素水平變化，對胰島素的降血糖效果無影響。

2.4.2 EGCG對血液中胰高血糖素含量的影響 胰高血糖素可以促進糖原分解和糖異生，使血糖明顯升高，這是影響血糖的重要因素[13-14]。如圖6所示，EGCG+INS聯(lián)用組、INS組、EGCG組及對照組在各個時間點的胰高血糖素的含量沒有顯著性差異，這表明EGCG不會影響糖尿病大鼠血液中胰高血糖素水平。

3 討 論

胰島素及胰高血糖素是調(diào)節(jié)人體血糖平衡的主要激素，在維持其穩(wěn)態(tài)確保血糖在正常水平非常重要。EGCG作為茶葉中的主要成分，山云等研究發(fā)現(xiàn)，茶葉中多酚類物質(zhì)有強吸附能力，對藥物的藥效有減弱的作用[8]。而EGCG作為茶多酚中主要成分，對于有飲茶習慣的糖尿病人，是否會影響其治療效果，目前尚無研究報道。

圖6 EGCG對血液胰高血糖素含量的影響Fig.6 Effect of EGCG on serum glucagon content

文章首先檢測了不同濃度的EGCG對血液中的胰島素和胰高血糖素含量的影響，以確定合適的EGCG濃度對糖尿病大鼠進行灌胃。其次通過模擬飲茶方式，對糖尿病大鼠進行EGCG灌胃，檢測機體血糖、胰島素和胰高血糖素水平，探討EGCG對胰島素治療糖尿病大鼠的影響。在體外實驗中，不同濃度的EGCG對胰島素含量檢測沒有影響，但高濃度的EGCG(2和/1 mg/mL)會使胰高血糖素的檢測值偏高，其具體原因有待于進一步研究。因此，在灌胃糖尿病大鼠時，宜將EGCG濃度控制在1 mg/mL以下，以保證試驗結(jié)果的準確性。

以往研究表明EGCG具有減緩胰島素抵抗的作用，Potenza等在大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)EGCG對胰島素有增敏作用[15]。但是針對胰島素缺乏的動物模型，EGCG有無作用未見文獻報道。糖尿病人往往會出現(xiàn)胰島素缺乏現(xiàn)象，也會常常采用胰島素治療。那么胰島素治療的糖尿病人是否能夠正常飲茶而不影響治療效果呢？這個問題有必要進行探討，從而為糖尿病人提供科學依據(jù)。本研究通過EGCG灌胃的方式，模擬飲茶習慣，觀察EGCG對胰島素注射后的糖尿病大鼠的降血糖作用。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG灌胃2 h內(nèi)，糖尿病大鼠的血糖水平并沒有降低，EGCG聯(lián)合胰島素組與胰島素組相比血糖差異不顯著，這與以往文獻[16-17]中報道不符，這可能與藥物干預時間過短或EGCG容易被氧化，生物利用度差的特點有關(guān)[18]。研究結(jié)果表明，聯(lián)用組與胰島素組之間，EGCG組與對照組之間胰島素和胰高血糖素的含量沒有顯著性差異，此結(jié)果說明飲用富含EGCG的茶對糖尿病病人血液中胰島素和胰高血糖素水平無影響，不會干擾胰島素藥效。

4 結(jié) 論

低濃度的EGCG處理(低于1 mg/mL)不會引起胰島素和胰高血糖素檢測的失真；EGCG對胰島素治療的糖尿病大鼠血液中血糖、胰島素和胰高血糖素水平檢測沒有影響。總之，飲用富含EGCG的茶不會影響使用胰島素治療的糖尿病病人血液中的血糖、胰島素和胰高血糖素水平，對胰島素的治療效果無影響。