基于溶血率的金銀花與山銀花質量差異研究

徐玉玲, 鄭 燕，葉 萌, 梁 鑫,王 晨，潘春暉，楊紅玉

(1.成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；2.四川德成動物保健品有限公司，四川 德陽 618000)

0 引 言

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花.“金銀花”一名，始載于宋代方書《蘇沈良方》，至明代《本草綱目》，除藤葉藥用以外，開始強調以花入藥[1].藥理研究表明，金銀花具有抑菌、抗病毒、解熱及降血脂等作用[2].山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1].山銀花具多種藥理作用，具有抑菌殺菌、抗病毒、抗炎、抗過敏和肝臟保護等作用[3].楊倩茹等[4]對金銀花與山銀花化學成分進行研究表明，金銀花較山銀花含有較豐富的環(huán)烯醚萜類和黃酮類化合物，而山銀花中三萜皂苷類化合物種類較多.目前，金銀花是中藥注射劑中的常用組分，如清開靈注射液、熱毒寧注射液、注射用雙黃連凍干粉等[5].據(jù)文獻報道，皂苷類成分一般具有溶血作用，當其制備成注射劑時，需考慮其溶血風險[6-9].對此，本實驗對比分析了金銀花藥材與山銀花藥材的體外溶血作用，擬對二者的內在質量進行分析評價.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用材料包括：金銀花、山銀花藥材購置于不同藥店，經(jīng)成都大學劉濤研究員鑒定，山銀花藥材品種為灰氈毛忍冬，金銀花與山銀花藥材來源分別見表1、表2；0.9% NaCl注射液(批號，B15042001)，購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；水為藍光純凈水，其余試劑均為分析純；新西蘭大白兔(合格證號，SCXK(川)2013-17)，購自成都達碩實驗動物有限公司.

表1 金銀花來源

表2 山銀花來源

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：TU-1810PC型紫外—可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；BS-6KH型電子分析天平(上海友聲衡器有限公司)；HS-3120型超聲清洗器(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；TD5型離心機(長沙英泰儀器有限公司).

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

取金銀花粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70% 甲醇溶液100 mL，稱重，超聲處理20 min，稱其質量，用70% 甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過.取續(xù)濾液50 mL于蒸發(fā)皿(多次加入)，于70 ℃水浴蒸干，加入40 μL二甲基亞砜，超聲助溶，再加入生理鹽水進行稀釋，將該溶液置于100 mL量瓶中，定容，得金銀花樣品儲備液.取儲備液適量，加生理鹽水分別稀釋成含金銀花質量濃度為0.5 g/L、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L的供試品溶液[5].同時，采用相同方法制備山銀花樣品的供試品溶液.

2.2 紅細胞混懸液的制備

從實驗家兔耳緣靜脈取新鮮血液20 mL，置燒杯中，用纏有少量脫脂棉的玻璃棒輕輕攪拌10 min，取出血液中的纖維蛋白，制成脫纖血液，加入約10 倍量生理鹽水，搖勻，于3 000 r/min離心10 min，棄去上清液.按此方法重復4～5次，洗至上清液呈無色透明，將所得紅細胞用生理鹽水配制成壓積為2% 的紅細胞混懸液，置于4 ℃冰箱中保存，備用[10].

2.3 溶血率的測定

溶血率采用紫外—可見分光光度法進行測定，具體步驟為：

以3 mL生理鹽水中加入兔紅細胞混懸液 3 mL為陰性組；以3 mL水中加入兔紅細胞混懸液3 mL為陽性組(滲透壓的改變造成紅細胞完全溶血)；以按“2.1”項下供試品溶液制備方法制備的不同質量濃度的金銀花供試品溶液與山銀花供試品溶液各3 mL分別加入兔紅細胞混懸液3 mL作為樣品組.將各組溶液輕輕振搖，混合均勻，置(37±0.5)℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫3 h，保溫完畢取出，于2 000 r/min離心10 min，吸取上清夜至比色皿中.以陰性組為空白，采用比色法于540 nm波長下分別測定陽性組的吸光度(A陽)和樣品組的吸光度(A樣).由于金銀花與山銀花供試品溶液具有吸光度，因此加入兔血后測出的吸光度需減去金銀花與山銀花供試品溶液的吸光度(A空).并按照溶血率=(A樣-A空)/A陽×100%，計算溶血率.

2.4 實驗結果

3批金銀花樣品與3批山銀花樣品不同質量濃度下的溶血率見表3、表4.

表3 金銀花樣品不同質量濃度下溶血率

表4 山銀花樣品不同質量濃度下溶血率

3 結果分析

3.1 相似度分析

將3批金銀花樣品作為一組標準樣品，利用數(shù)據(jù)處理軟件“IBM SPSS statistics"中雙變量相關“Kendall的tau-b"依次對3批山銀花樣品進行相似度分析，并進行相似度測算，結果見表5.

表5 金銀花與山銀花樣品相似度分析表

由表5可知，金銀花樣品與山銀花樣品溶血率相似度最高為73.3%，最低為27.6%.此表明，金銀花樣品的內在質量與山銀花樣品的內在質量存在差異.

3.2 溶血率—質量濃度曲線分析

將3批金銀花藥材及3批山銀花藥材在不同質量濃度下的溶血率計算平均值，建立溶血率—質量濃度曲線，結果見圖1.

由圖1(H1)可見，當金銀花樣品溶液質量濃度≤1.0 g/L時，不存在體外紅細胞溶血現(xiàn)象；在質量濃度為2.0 g/L時溶血率急劇增大；在質量濃度為4.0 g/L時，溶血作用基本達到最大；在質量濃度為5.0 g/L時溶血率基本達到平衡.

由圖1(H2)可見，當山銀花樣品溶液質量濃度≤1.0 g/L時，不存在體外紅細胞溶血現(xiàn)象；在質量濃度為2.0 g/L時溶血率急劇增大，在質量濃度為3.0 g/L時，溶血作用基本達到最大，在質量濃度為4.0 g/L時溶血率基本達到平衡.

圖1金銀花、山銀花樣品溶血率—質量濃度曲線

實驗結果表明，金銀花樣品的最大溶血率小于山銀花樣品，且達到最大溶血率的質量濃度較山銀花大，說明金銀花樣品與山銀花樣品內在質量存在差異，其原因是金銀花樣品含皂苷類化合物較山銀花少.

3.3 “Smirnov”分析

根據(jù)判定“可疑值"能否舍棄的“Smirnov"法，以3批金銀花不同質量濃度下溶血率為一組，判定每一批山銀花樣品的相似度Ti是否為可疑值，如為可疑值，應該舍棄不用.

Ti=|(Xi-X)|/S

式中，Xi為可疑值，X為包括可疑值在內的平均數(shù)，S為標準差[11].

查詢“Smirnov”法附表，n=4時，Ti>1.689，表明有顯著性差異.不同質量濃度下樣品的Ti值見表6.

表6 金銀花樣品與山銀花樣品可疑值分析表

由表6可知，r2的Ti(1 g/L)與Ti(5 g/L)的Ti值>1.689，r3的Ti(2 g/L)的Ti值>1.689，其余值均<1.689，表明山銀花樣品中r2的Ti(1 g/L)、Ti(5 g/L)與r3的Ti(2 g/L)為可疑值，應舍去，即山銀花樣品r2、r3與3批金銀花樣品比較，具有顯著性差異.

3批山銀花藥材樣品中，有2批樣品與金銀花樣品存在顯著性差異，表明金銀花藥材與山銀花藥材溶血作用存在顯著性差異.

4 討 論

黃娜等[5]研究表明，金銀花藥材與山銀花藥材具有體外溶血作用，作為注射劑時，具有潛在溶血風險，溶血作用的產(chǎn)生源于二者皂苷的含量，本研究基于金銀花藥材與山銀花藥材存在體外溶血的作用，采用紫外—可見分光光度計法對二者溶血作用進行分析，通過二者溶血作用差異，進一步說明二者的皂苷種類與含量存在差異，繼而說明金銀花藥材與山銀花藥材內在質量存在差異.現(xiàn)有文獻對二者進行質量分析時，均對二者主要成分及含量進行分析，缺少對各成分間相互作用的研究，本實驗基于二者藥效作用分析，進一步表明二者存在差異.

本研究采用“IBM SPSS Statistics”軟件分析了金銀花標準樣品組與山銀花各批次之間差異，表明二者相似度較低；采用溶血率—質量濃度曲線分析，金銀花樣品出現(xiàn)溶血率最大值時質量濃度較山銀花樣品大，表明金銀花樣品皂苷含量較山銀花樣品少；采用“Smirnov"分析，表明山銀花樣品與金銀花樣品存在顯著性差異.3種分析方式的聯(lián)用，均表明二者質量間存在差異.

研究發(fā)現(xiàn)，不同批次金銀花樣品間相同質量濃度下溶血率相差較大，質量濃度為3 g/L時，RSD為80.29%；不同批次山銀花樣品間相同質量濃度下溶血率相差也較大，質量濃度為2 g/L時，RSD為130.95%.此表明金銀花樣品與山銀花樣品間差異可能來源于藥材本身，且本實驗僅基于品種為灰氈毛忍冬的山銀花藥材的研究，不能說明金銀花藥材與山銀花藥材內在質量存在較大差異.此表明，在分析藥材間質量時，需對藥材本身質量進行探討，而現(xiàn)有文獻缺乏該方面討論.

此外，金銀花藥材與山銀花藥材質量濃度為2 g/L時已出現(xiàn)體外溶血.體外溶血率與甲醇濃度、超聲時間、二甲基亞砜用量及樣品保溫時間存在較大聯(lián)系，當上述條件發(fā)生變化時，會出現(xiàn)溶血率降低甚至不出現(xiàn)溶血的狀況.楊光[12]研究表明，皂苷可以同血紅細胞壁上的膽甾醇結合生成不溶性分子復合物沉淀，造成血紅細胞正常滲透性被破壞而發(fā)生崩解，進而產(chǎn)生溶血作用.本實驗樣品制備方式極大程度提取了皂苷，從而發(fā)生了體外溶血作用.

本研究采用體外溶血作用對金銀花藥材與山銀花藥材內在質量的分析克服了現(xiàn)有文獻對主要成分分析的不完整性，也進一步說明了中藥作用的多成分、不確定性，實驗方法與結果為中藥內在質量差異研究提供了一種新的思路.