錦繡杜鵑葉抗菌活性及其有效部位研究

劉 兵，唐佳慧，李松慧，徐寶貴，宋明霞

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錦繡杜鵑葉抗菌活性及其有效部位研究

劉 兵，唐佳慧，李松慧，徐寶貴，*宋明霞

（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江西，吉安 343009）

為了研究錦繡杜鵑葉的抗菌活性，本實(shí)驗(yàn)采用了甲醇冷浸法、乙醇回流法和微波萃取法分別對(duì)錦繡杜鵑葉的有效成分進(jìn)行提取，并采用微孔板稀釋法測(cè)試提取物對(duì)多種陽性菌、陰性菌和耐藥菌的抑制活性，通過紫外分光光度法測(cè)定了各萃取物的總黃酮含量。此外，為了獲取錦繡杜鵑葉抗菌作用的有效部位，本實(shí)驗(yàn)將提取物分別用石油醚、乙酸乙酯和水萃取得到不同極性的萃取物組分，比較其抑菌活性。結(jié)果顯示：乙醇回流法獲得的粗提物的抗菌活性最佳，對(duì)銅綠假單胞27853的MIC值達(dá)到了0.512 mg/mL；各萃取組分中，水萃取組分和乙酸乙酯萃取組分的抗菌效果最好，三種提取方法得到的水萃取組分對(duì)金黃色葡萄球菌26003均達(dá)到1.024 mg/mL，微波萃取法得到的乙酸乙酯萃取組分對(duì)銅綠假單胞菌27853的MIC值達(dá)到了0.512 mg/mL。本研究證實(shí)了錦繡杜鵑葉具有較好的的抗菌活性，其抗菌作用的有效部位為水層提取部位，為錦繡杜鵑葉在抗菌藥物和相關(guān)產(chǎn)品研究開發(fā)方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

錦繡杜鵑葉；微波萃取；抗菌活性；耐藥菌

0 引言

近年來隨著對(duì)抗菌藥物研究的不斷深入，人們逐漸意識(shí)到化學(xué)藥物的過度使用帶來了諸多問題，抗生素長期使用及不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性問題日益加劇，藥物殘留問題和食品安全問題也受到越來越多的關(guān)注。因此有必要開發(fā)和利用純天然中藥來解決這一問題。杜鵑花（學(xué)名：.），又名滿山紅、映山紅、山石榴，為常綠或平常綠灌木。該物種全株供藥用，有行氣活血、補(bǔ)虛，可治療內(nèi)傷咳嗽、腎虛耳聾、月經(jīng)不調(diào)、風(fēng)濕等疾病[1]。因花冠鮮紅色，為著名的花卉植物，具有較高的觀賞價(jià)值[1]，近年來還發(fā)現(xiàn)其活性成分具有良好的抗菌消炎、殺蟲、止咳平喘等作用。

陳國聯(lián)等人的研究發(fā)現(xiàn)多種杜鵑對(duì)多種常見致病菌有不同程度的殺菌作用，所測(cè)試的10種杜鵑皆為廣譜抗菌藥物[2]。任茜等人研究發(fā)現(xiàn)秀麗杜鵑和汶川杜鵑的抗菌作用強(qiáng)于或相當(dāng)于黃連[3-5]。文獻(xiàn)報(bào)道杜鵑植物中含有黃酮、二萜類、三萜類等多種活性成分[6]，其黃酮主要化學(xué)成分為金絲桃苷、槲皮素及映山紅素等黃酮化合物，具有鎮(zhèn)痛、抗炎抑菌、抗氧化等多方面的藥理活性[7]。

錦繡杜鵑()，也稱毛杜鵑，在我國江蘇、福建、江西等地分布廣泛，常用于園林和屋前舍后的綠化美觀[8]，其主要成分為黃酮類物質(zhì)[8]，具有較好的祛痰、止咳作用。鑒于錦繡杜鵑分布廣泛，易于成活以及其同樣富含黃酮類成分等特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)擬研究其抗菌活性，對(duì)其抗菌活性部位進(jìn)行追蹤，初步獲得其有效部位，并比較不同提取方法對(duì)抗菌活性成分的提取優(yōu)劣。具體以江西省井岡山大學(xué)校園景觀植物錦繡杜鵑的葉為原料，采用甲醇冷浸法、乙醇回流法、微波萃取法三種不同方法提取，并使用石油醚、乙酸乙酯和水進(jìn)行萃取，測(cè)試三種提取方法獲得的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物的體外抗菌活性，從而為錦繡杜鵑葉的抗菌活性成分的提取分離和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SSW-420-2S型電熱恒溫水槽（上海博訊有限公司），WT30001B電子天平（常州萬泰天平儀器有限公司），ZNHW型電熱套（上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司），MAS-П微波提取器（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-3000(上海亞榮生化儀器廠)，DHG-9075A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），iMark酶標(biāo)儀（美國伯樂公司），ST2100實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)（奧豪斯儀器（常州）有限公司），SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)（普通型，蘇州凈化設(shè)備有限公司），HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱（江蘇太倉市華美生化儀器廠），GRP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），KXQ-LS高壓滅菌儀（上海博訊有限公司），Tu-1901紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用公司），DV215CD電子天平（美國奧豪斯公司）。

1.2 試劑與材料

錦繡杜鵑葉（采自江西吉安，經(jīng)井岡山大學(xué)藥學(xué)系梁兆昌教授鑒定），G116212甘油（阿拉丁試劑公司，500 mL)，CM1135 BRAIN HEART INFUSION(BHI) (英國OXOID公司，500 g makes 13.5 litres)，CM1168 NUTRIENT BROTH(英國OXOID公司，500 g makes 38.4 litres)，TRYPTONE SOYA BROTH(TSB)(英國OXOID公司)，二甲亞砜（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純 AR 500 mL），無水乙醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司，分析純AR500 mL），蘆丁（阿拉丁工業(yè)公司）；菌種購自中國科學(xué)院微生物研究所與北納生物科技有限公司。

2 方法

2.1 錦繡杜鵑葉提取前處理

葉采摘后陰涼通風(fēng)處自然風(fēng)干，粉碎成40目篩粉末備用。

2.2 錦繡杜鵑葉不同溶劑提取物的制備

2.2.1 甲醇冷浸法

取50 g錦繡杜鵑葉干燥粉末用95%的甲醇按料液比1:10（m/v），室溫避光浸48 h，每24 h振蕩1次，濾渣依次再用1:10的95%甲醇溶液浸提，連續(xù)3次，合并3次提取液減壓濃縮得浸膏。稱取0.1 g甲醇冷浸所得浸膏于離心管中留用，將剩余浸膏按1:20（m/v）溶于水中，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯萃取三次，獲得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、水萃取物，濃縮溶劑后得到各自的浸膏[9-12]。

2.2.2 乙醇回流提取法

取50 g錦繡杜鵑葉干燥粉末用75%的乙醇按料液比1：10（m/v），120 ℃電熱套加熱回流，每次1 h。過濾得濾液，濾渣依次再用1：10的75%乙醇溶液加熱回流1.0 h，連續(xù)3次，合并3次提取液減壓濃縮得浸膏。稱取0.1 g乙醇回流所得浸膏于離心管中留用，將剩余浸膏按1：20（m/v）溶于水中，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯萃取3次，獲得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、水萃取物，濃縮溶劑后得到各自的浸膏[13-17]。

2.2.3 微波萃取法

取50 g錦繡杜鵑葉干燥粉末用75%的乙醇按料液比1:10（m/v），微波功率400 W，70 ℃條件萃取30 min，稍冷，過濾，濾渣依次再用1:10的75%乙醇溶液進(jìn)行微波萃取，連續(xù)3次，合并3次提取液減壓濃縮得浸膏。稱取0.1 g微波萃取浸膏于離心管中留用，將剩余浸膏按1:20（m/v）溶于水中，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯萃取3次，獲得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、水萃取物，濃縮溶劑后得到各自的浸膏[18-19]。

2.3 抗菌實(shí)驗(yàn)

2.3.1 待測(cè)物的處理

將以上三種提取方法得到的粗浸膏以及其石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、水萃取物濃縮后的浸膏共12種浸膏作為抗菌實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用DMSO配制為初始測(cè)試濃度2.048 mg/mL的待測(cè)藥液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 菌液制備

將金黃色葡萄球菌26003、金黃色葡萄球菌25923、枯草芽孢桿菌63501、糞腸球菌29212、變異鏈球菌336931(1:50接種，靜置培養(yǎng))，大腸桿菌44568、大腸桿菌25922、銅綠假單胞菌10104、銅綠假單胞菌27853以及金黃色葡萄球菌33591、金黃色葡萄球菌43300、銅綠假單胞菌BAA-2111、大腸桿菌BAA-196按1:1000接種于Mueller-Hinton broth (MHB) 或者Tryptone Soya Broth (TSB) 或者Brain Heart Infusion(BHI)培養(yǎng)液中37 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h，取菌落用培養(yǎng)液稀釋成105CFU/mL。

2.3.3 抗菌活性MIC值的測(cè)定

于含4 μL藥液（濃度為2.048 mg/mL）和96 μL無菌培養(yǎng)液的96孔板中，加入100 μL菌液。在微型振蕩器上震蕩數(shù)秒后，用酶標(biāo)儀在620 nm波長下測(cè)定培養(yǎng)前的吸光度值。將微孔板置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18~24 h后，再用酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)后的吸光度值，綜合兩次數(shù)據(jù)，根據(jù)式（1）計(jì)算藥液對(duì)各菌的抑制率。以計(jì)算結(jié)果抑制率超過80%的定為具有抑菌活性，繼續(xù)用連續(xù)稀釋法測(cè)定其MIC值（抑制率超過80%的最小濃度為最低抑菌濃度，即MIC值）[20-21]。

抑制率= 1-Δλ/Δλ空白（1）

注：Δλ = 培養(yǎng)后每組數(shù)據(jù)的平均值-培養(yǎng)前每組數(shù)據(jù)的平均值；Δλ空白= 培養(yǎng)后空白組的平均值-培養(yǎng)前空白組的平均值

2.4 提取物黃酮含量的測(cè)定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[22-28]

精密稱取20 mg蘆丁置于100 mL容量瓶中，加70%的乙醇溶液完全溶解并定容至刻度，配置0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL標(biāo)準(zhǔn)液，分別放入25 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，10%三氯化鋁溶液0.3 mL，用70%乙醇溶液定容，搖勻，依照紫外分光光度法，在410 nm波長處測(cè)定吸光度（A吸光度），所測(cè)結(jié)果見表1。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ρmg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度（A吸光度）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程C = 0.03268A+0.00026，r = 0.9979，并作出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線表

Table 1 Standard curve table

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4.2 直接比色法含量測(cè)定

取2.2中三種提取方法得到的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、水萃取物濃縮后的浸膏共9種浸膏為測(cè)定對(duì)象，稱取每種浸膏100 mg放入25 mL量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，10%三氯化鋁溶液0.3 mL，加70%乙醇至刻度，測(cè)定410 nm波長吸收值，將吸收值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各浸膏中黃酮含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 三種提取方法提取率的比較

三種提取方法中，微波萃取法提取率最高，甲醇冷浸法和乙醇回流法的提取率相差不大（結(jié)果見表2），說明微波萃取法確實(shí)是一種良好的中藥材有效成分提取方法。微波萃取時(shí)，高頻電磁波可以穿透萃取介質(zhì)，到達(dá)被萃取物料的內(nèi)部，使得細(xì)胞內(nèi)部的溫度快速升高，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)部的壓力達(dá)到某一臨界點(diǎn)時(shí)，細(xì)胞就會(huì)破裂，有效成分流出并溶解于萃取介質(zhì)。三種粗提物溶于水分別用石油醚、乙酸乙酯萃取得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、水萃取物。它們分別的提取率如表2所示，甲醇冷浸法得到的石油醚萃取物含量最多，乙醇回流和微波萃取法均是水萃取物更多。

表2 三種提取方法的提取率比較

a提取率 = 浸膏質(zhì)量/提取所用藥材粉末質(zhì)量*100%

3.2 三種粗提物抑菌活性的比較

本實(shí)驗(yàn)選取了13種細(xì)菌包括陰性菌、陽性菌和耐藥菌用于杜鵑花提取物體外抗菌活性的評(píng)價(jià)。如表3所示，三種提取方法獲得的粗提物中，甲醇冷浸法和微波萃取法所得浸膏在2.048 mg/mL劑量下幾乎沒有顯示出抗菌活性；而乙醇回流法所得浸膏對(duì)大多數(shù)所選細(xì)菌包括兩個(gè)耐藥菌株，均顯示出較好的抗菌活性，對(duì)部分菌株的MIC值達(dá)到0.512 mg/mL。

表3 甲醇冷浸法、乙醇回流法和微波萃取法粗提物抑菌活性比較（MIC值，mg/mL）

3.3 粗提物萃取組分的抑菌活性比較

為了尋找錦繡杜鵑葉抗菌作用的有效部位，更好地為后續(xù)活性物質(zhì)追蹤提供依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)將三種提取法所得粗提物依次進(jìn)行石油醚和乙酸乙酯萃取，分別將獲得的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物進(jìn)行抗菌活性篩選。對(duì)5種陽性菌的抑菌活性見表4?？偟膩碚f，錦繡杜鵑葉提取物對(duì)金葡菌顯示出較好的抑菌活性，對(duì)枯草芽孢桿菌、糞腸球菌和變異鏈球菌在2.048 mg/mL濃度下也顯示一定活性。比較三種萃取物的抗菌活性，可以看出水萃取物的活性最好，其次是乙酸乙酯萃取物，最后是石油醚萃取物。三種粗提方法得到的水萃取組分對(duì)金葡菌26003的抗菌活性MIC值均達(dá)到1.024 mg/mL。

表4 各萃取物對(duì)革蘭氏陽性菌的抗菌活性MIC值 (mg/ml)

各種萃取物對(duì)4種常見陰性菌的抑菌活性結(jié)果見表5。從表中可以看出，不同萃取物中，石油醚萃取物在2.048 mg/mL濃度下幾乎沒有顯示出抗菌活性，而微波萃取組的乙酸乙酯萃取物和水萃取物對(duì)銅綠假單胞菌抗菌活性較好，分別達(dá)到了0.512、2.048 mg/mL。

表5 各萃取物對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌活性MIC值 (mg/mL)

各萃取物對(duì)耐藥菌的抗菌活性見表6。結(jié)果顯示各萃取組分對(duì)四種耐藥菌的抗菌活性均較弱，對(duì)金黃色葡萄球菌33591在2.048 mg/mL濃度條件下均沒有顯示出抗菌活性，對(duì)其他三種耐藥菌抗菌活性區(qū)別不大；甲醇冷浸法和乙醇回流法得到的萃取物對(duì)四種耐藥菌在2.048 mg/mL濃度條件下幾乎沒有抗菌活性，微波萃取組的乙酸乙酯層和水層對(duì)金葡菌43300、銅綠假單胞BAA-2111、大腸桿菌BAA-196的MIC值均達(dá)到了2.048 mg/mL。

表6 三種粗提物不同溶劑萃取物對(duì)耐藥菌的抗菌活性MIC值 (mg/mL)

Table 6 Antibacterial activity MIC of different solvent extracts of three crude extracts against resistant bacteria

總的來說，錦繡杜鵑葉的粗提物用不同溶劑萃取后，對(duì)細(xì)菌的抑制活性強(qiáng)弱有別，活性順序?yàn)椋核腿∥? 乙酸乙酯萃取物> 石油醚萃取物。從不同菌種類型來看，錦繡杜鵑葉對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制活性要強(qiáng)于革蘭氏陰性菌。

3.4 萃取物抗菌活性與其總黃酮含量的關(guān)系

由3.3討論可知，在石油醚、乙酸乙酯和水的三個(gè)萃取組分中，水萃取物顯示出更好的抗菌活性。為了探究黃酮類物質(zhì)是否為錦繡杜鵑葉的主要抗菌活性成分，對(duì)各萃取組分進(jìn)行了黃酮含量測(cè)定。黃酮含量結(jié)果見表7。從表中可以看出，三種粗提物的乙酸乙酯萃取組分中黃酮含量均較高，這一點(diǎn)與其較高的抗菌活性相吻合，說明錦繡杜鵑葉抑菌活性與總黃酮含量確實(shí)存在著一定的相關(guān)性，可初步斷定黃酮類是錦繡杜鵑葉的抑菌活性成分之一。在三種提取方法中，水萃取物中黃酮含量都最低，這與黃酮類物質(zhì)的本身性質(zhì)相關(guān)，但由3.3部分可知水萃取物的抑菌活性較高，據(jù)此推測(cè)杜鵑葉的抗菌活性還來自于黃酮以外的其他成分。根據(jù)進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)，石天松[29]、趙璽[10]、趙寶琴等[7]在中藥滿山紅中分離出黃酮類、香豆素類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類等數(shù)十種重要化學(xué)成分，據(jù)此猜測(cè)杜鵑葉中有效抗菌活性很有可能來自于有機(jī)酸類、香豆素類以及揮發(fā)油類或者其他化學(xué)成分。

表7 各萃取物總黃酮含量

4 小結(jié)

本研究證實(shí)了錦繡杜鵑葉中含有廣譜抗菌的有效成分，對(duì)常見的革蘭氏陽性菌和陰性菌以及耐藥菌均表現(xiàn)出抑制活性。其抑菌活性可能與黃酮及其他成分如香豆素類、有機(jī)酸類或者揮發(fā)油類成分有關(guān)。在提取方法研究中，微波萃取法和乙醇回流法在提取抗菌活性物質(zhì)方面要優(yōu)于甲醇冷浸法，且提取率較高。粗提物用不同溶劑萃取后，不同萃取層之間抗菌活性依次為：水萃取物> 乙酸乙酯萃取物> 石油醚萃取物，說明錦繡杜鵑葉中的抗菌有效部位是水層和乙酸乙酯層，這為后續(xù)的抗菌有效成分的分離提供了指導(dǎo)。

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ANTIBACTERIAL ACTIVITIES OFLEAVES AND ITS ACTIVE FRACTION

LIU Bing, TANG Jia-hui, LI Song-hui, XU Bao-gui,*SONG Ming-xia

(Health Science Center, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

To investigate the antibacterial activities of the extraction ofleaves and its different extraction methods for antibacterial active substances. Extraction methods including methanol soaking, ethanol refluxing and microwave extracting were carried out. The antibacterial activities of the extracted components were evaluated by microporous plate dilution test using various positive bacteria, negative bacteria and antibiotic resistant bacteria as the tested bacteria. The total flavonoid content of different extractions were determined by ultraviolet spectroscopy. Additionally, the crude extract was extracted with petroleum ether, ethyl acetate and water respectively to get three different polar components, which were also subjected to the antibacterial test. The resdlts indicated that The ethanol refluxing method was superior to the other extract methods in the aspect of antibacterial activity. Furthermore, the water phase and the ethyl acetate phase had better antibacterial effects than the petroleum ether phase, the water phases in three methods all had antibacterial activities against26003 with a MIC value of 1.024 mg/Ml. The ethyl acetate phase from microwave extracting expressed antibacterial activities against27853 with a MIC value of 0.512 mg/mL.leaves exhibited antibacterial activities, and the water extract was the effective antibacterial ingredients. It provides experimental evidences for the research and development ofleaf as antibacterial agents or related products.

leaf; microwave-assisted extraction; antibacterial activity; drug-resistance bacteria

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2019.02.006

1674-8085(2019)02-0025-06

2018-12-12；

2019-01-08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81560561)

劉 兵(1966-)，女，江西吉安人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥用植物的提取分離(E-mail: 1277544374@qq.com);

唐佳慧(1983-)，女，江西吉安人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥用植物的提取分離(E-mail:643556068@qq.com);

李松慧(1997-)，女，安徽安慶人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)專業(yè)2015級(jí)本科生(E-mail: 1762277817@qq.com);

徐寶貴(1996-)，女，云南曲靖人，井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)專業(yè)2015級(jí)本科生(E-mail: 1871133084@qq.com);

*宋明霞(1983-)，女，山西介休人，副教授，博士，主要從事抗菌先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)修飾(E-mail: freexiaoxiao83@aliyun.com).