微生物學(xué)無菌操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)改進(jìn)

葉泉清

(廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006)

建立“無菌概念”和掌握“無菌操作技術(shù)”是學(xué)習(xí)微生物學(xué)的學(xué)生必須經(jīng)受的最基本的訓(xùn)練。所謂“無菌操作”是指通過一定的技術(shù)來保證目的微生物在轉(zhuǎn)移過程中不被環(huán)境中的微生物污染，這些技術(shù)包括用接種環(huán)(針)、吸管、涂棒等工具進(jìn)行接種、稀釋、涂片、計(jì)數(shù)和劃線分離等[1]。由于無菌操作的規(guī)范性直接影響到后續(xù)實(shí)驗(yàn)，高校教師在近些年進(jìn)行的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革中愈加重視無菌操作技術(shù)，例如，張杰等[2]確立了基礎(chǔ)的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)以無菌操作技術(shù)為核心展開課程的合理設(shè)置；黃碧芳等[3]通過挖掘無菌操作技術(shù)的基礎(chǔ)性和內(nèi)在知識(shí)的聯(lián)系性設(shè)計(jì)關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)。廣西師范大學(xué)的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)面向生物科學(xué)、生物技術(shù)、環(huán)境生態(tài)工程專業(yè)開設(shè)，使用的教材是沈萍、陳向東主編的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(第4版)，該書的“實(shí)驗(yàn)2無菌操作技術(shù)”主要內(nèi)容是用接種環(huán)轉(zhuǎn)接菌種；教學(xué)時(shí)，通常老師先演示操作過程并講解，之后學(xué)生獨(dú)自逐步模仿，并參考教材上的操作步驟以及圖示調(diào)整動(dòng)作，老師進(jìn)行巡視和糾錯(cuò)。實(shí)踐結(jié)果表明，在這種教學(xué)模式下，學(xué)生容易出現(xiàn)接種環(huán)灼燒滅菌不徹底，不能保持在酒精燈火焰旁邊完成整個(gè)操作等問題，無菌操作不夠規(guī)范，教學(xué)效果與預(yù)期目標(biāo)有差距，與該實(shí)驗(yàn)的重要性不相稱。這主要是由于教材內(nèi)容的某些不足導(dǎo)致學(xué)生對(duì)操作的要求認(rèn)識(shí)不到位，而老師在做操作講解時(shí)缺少相應(yīng)提示或強(qiáng)調(diào)不夠，以致學(xué)生出現(xiàn)操作錯(cuò)誤卻意識(shí)不到的情況；此外，菌種斜面使用棉塞與教材中使用試管帽不一致使得學(xué)生在操作時(shí)產(chǎn)生困惑，影響到操作的正確性。因此，探討問題的成因，并對(duì)教學(xué)內(nèi)容做適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，使學(xué)生在初次學(xué)習(xí)無菌操作時(shí)對(duì)操作要求有清晰而充分的認(rèn)識(shí)，并掌握規(guī)范的轉(zhuǎn)接菌種的操作，為后續(xù)對(duì)其他無菌操作的學(xué)習(xí)奠定良好基礎(chǔ)是十分必要的。關(guān)于無菌操作技術(shù)的研究，文獻(xiàn)報(bào)道集中在植物組培[4-5]、食品微生物檢驗(yàn)[6-7]、醫(yī)療護(hù)理[8-9]、無菌制劑生產(chǎn)[10-11]、食用菌生產(chǎn)[12]等領(lǐng)域，在微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)上的研究報(bào)道較少。本文就該實(shí)驗(yàn)教學(xué)中學(xué)生用接種環(huán)轉(zhuǎn)接菌種的無菌操作出現(xiàn)的主要問題展開探討，并提出改進(jìn)建議；另外，結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)歸納出使用棉塞的菌種斜面的轉(zhuǎn)接操作步驟，作為教材內(nèi)容的補(bǔ)充，以滿足實(shí)際教學(xué)的需要，并可作為開展斜面接種工作的參考。

1 教學(xué)過程中出現(xiàn)的問題及探討

1.1 拿捏接種環(huán)、試管等的手部姿勢不正確

在教學(xué)中發(fā)現(xiàn)不少學(xué)生受平時(shí)習(xí)慣的影響，多使用右手以掌背朝上的姿勢拿捏接種環(huán)，于是便看到相應(yīng)的操作：拔試管塞(帽)時(shí)，右手掌為了讓手掌邊緣靠近并夾住試管塞(帽)拔出，必須翻轉(zhuǎn)掌心朝上，這導(dǎo)致拇指與食指拿捏的接種環(huán)也翻轉(zhuǎn)180°，環(huán)端從火焰旁邊掉轉(zhuǎn)離開，使已滅菌的接種環(huán)可能染上雜菌；有的學(xué)生甚至沒有翻掌即順手拔塞，結(jié)果使試管塞的塞入部分被夾在掌緣內(nèi)側(cè)，可能被手掌的雜菌污染。而當(dāng)使用左手以掌背朝上的姿勢拿捏菌種斜面試管，刮取菌苔時(shí)手的背面會(huì)遮擋試管下部，學(xué)生為了看清刮菌位置及接種環(huán)是否刮上菌，只好俯身側(cè)頭觀看，縮短了身體與管口操作區(qū)的距離，如圖1所示；或者無意間把試管口從火焰旁邊移開拉近到眼前位置操作，兩種方式都增加了污染風(fēng)險(xiǎn)。可見，正確拿捏接種環(huán)、試管的手部姿勢對(duì)后續(xù)操作有較大的影響，有必要予以規(guī)范從而避免學(xué)生的隨意性。而教材在操作步驟和圖題說明中沒有準(zhǔn)確的手部姿勢描述和應(yīng)用要求，學(xué)生在看圖時(shí)未必關(guān)注手部姿勢并準(zhǔn)確模仿，當(dāng)老師重視不夠的情況下，學(xué)生的拿捏動(dòng)作難免表現(xiàn)隨意。

圖1 以掌背朝上的手勢拿捏接種環(huán)、菌種斜面的取菌操作

1.2 不能保持在酒精燈火焰旁邊完成整個(gè)操作

在實(shí)驗(yàn)過程，有的學(xué)生站著操作，管口遠(yuǎn)離酒精燈火焰；有的學(xué)生在火焰旁邊拔塞、刮取菌苔，而塞棉塞、接入菌種時(shí)則偏離火焰較遠(yuǎn)，沒有始終保持在火焰旁邊完成操作。其原因包括：或是怕燙到手，或是不清楚距離酒精燈火焰多遠(yuǎn)才合適，也有因手部姿勢不正確導(dǎo)致。而教材在基本原理中闡述了高溫對(duì)微生物具有致死效應(yīng)，因此在微生物的轉(zhuǎn)接過程中，一般在火焰旁進(jìn)行，操作步驟中也多處寫明在火焰旁如何做，但都沒有給出一個(gè)明確的距離，因而學(xué)生不好把握，僅能憑個(gè)人臆測去做。學(xué)生認(rèn)識(shí)上的模糊反映出教材在基本原理中闡述不夠清晰，內(nèi)容有欠缺，而老師不注意對(duì)無菌操作范圍作進(jìn)一步的說明，學(xué)生無法理解透徹，沒有形成“無菌操作范圍”的觀念，內(nèi)心無準(zhǔn)繩就難免出錯(cuò)。

1.3 接種環(huán)的灼燒長度較短，滅菌不徹底

轉(zhuǎn)接菌種前要求對(duì)接種環(huán)進(jìn)行火焰灼燒滅菌，在教學(xué)中看到不少學(xué)生灼燒了環(huán)端及鎳鉻絲段就止住，沒有延伸灼燒金屬桿前段，而該部位在接種時(shí)往往會(huì)伸入到試管中，也需要滅菌。此前，老師做了示教演示，可能因動(dòng)作連貫，邊做邊說，有的學(xué)生未必注意到接種環(huán)灼燒到金屬桿前段這一細(xì)節(jié)；另外，老師還可能疏忽了對(duì)灼燒長度的要求。而教材的圖示缺少詳細(xì)操作說明，學(xué)生在看圖未能弄清圖意時(shí)沒有獲得必要的提示，以致獨(dú)立操作中灼燒滅菌不到位卻未意識(shí)到錯(cuò)誤。

1.4 管口的灼燒滅菌不夠均勻、充分，容易引燃棉塞

教材的操作步驟(2)“在火焰旁打開斜面培養(yǎng)物的試管帽，并將管口在火焰上燒一下”[1]，我們沒有試管帽，用的是棉花塞，器材的不同令學(xué)生產(chǎn)生操作困惑，若照搬步驟(2)應(yīng)在火焰旁打開棉塞并將管口燒一下，對(duì)此，學(xué)生有疑問“打開棉塞時(shí)管口處粘附的雜菌是否因震動(dòng)掉落管內(nèi)引起污染？”。經(jīng)討論，認(rèn)為試管帽在外面包裹管口因而管口位置較為潔凈，打開后再將管口燒一下滅菌是可以的，而棉塞或硅膠塞從管口塞入，接縫處積存雜菌，且棉塞露空部分也粘附雜菌，因而拔塞前管口應(yīng)該先過火滅菌。不過，該操作缺乏規(guī)范，學(xué)生通常是順手將管口伸到火焰上方灼燒滅菌，這使得棉塞尾部的紗布很容易被點(diǎn)燃，如圖2所示。于是，改將管口伸到離火焰較高的位置快速過火，由于怕燒到棉塞，操作顯得匆忙而慌亂，管口部位沒有得到均勻、充分灼燒，滅菌不徹底。怎樣操作是安全而有效？這是對(duì)帶棉塞的管口或瓶口灼燒滅菌時(shí)通常遇到的問題，并令人困擾，而學(xué)生操作中的隨意發(fā)揮還存在安全隱患，因此，應(yīng)該探究如何規(guī)范操作以降低風(fēng)險(xiǎn)。

教學(xué)中出現(xiàn)的問題與教學(xué)方法、教學(xué)內(nèi)容密切相關(guān)，上述探討不難看出某些問題與教材內(nèi)容的不足之處也相關(guān)，體現(xiàn)在學(xué)生對(duì)酒精燈火焰旁邊的操作范圍不明確、教材圖示說明有欠缺、步驟中對(duì)易造成污染的操作細(xì)節(jié)提示不夠。因此，需要對(duì)教學(xué)內(nèi)容做適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)；對(duì)實(shí)際教學(xué)中因使用器材的不同導(dǎo)致操作的改變則需要?dú)w納形成新的操作步驟。

圖2 在火焰上方灼燒管口滅菌，容易引燃棉塞

2 對(duì)教學(xué)內(nèi)容的改進(jìn)

2.1 規(guī)范拿捏接種環(huán)、試管等的手部姿勢

教材中描述拿捏接種環(huán)、試管等的手部姿勢的內(nèi)容為：右手是掌心朝上，拇指在上方與下方的食指、中指相對(duì)拿捏接種環(huán)的金屬桿后端，左手也是掌心朝上，拇指在上方與食指、中指相對(duì)拿捏菌種斜面試管的下部，如圖3所示；并說明以這樣的手勢拔試管塞(帽)并灼燒管口、刮取菌苔，操作順手且有利于刮菌時(shí)的觀察。老師要做好示范動(dòng)作，并在開始操作時(shí)即明確提出應(yīng)用要求讓學(xué)生做出模仿，然后通過老師的巡視糾錯(cuò)，使部分學(xué)生留意到自己的習(xí)慣性手勢不利于開展操作。

圖3 以掌心朝上的手勢拿捏接種環(huán)、菌種斜面的取菌操作

2.2 明確在酒精燈火焰旁邊無菌操作的范圍

在基本原理中，增加酒精燈火焰周圍無菌區(qū)的知識(shí)點(diǎn)，明確操作范圍，使學(xué)生可以較詳細(xì)地了解無菌操作在火焰旁進(jìn)行的道理，弄清楚操作時(shí)與火焰的距離。酒精燈火焰的高溫輻射對(duì)微生物有致死效應(yīng)，燃燒導(dǎo)致的氣流上升使攜帶微生物的塵埃難以停留、降落，因此在酒精燈火焰的周圍產(chǎn)生一個(gè)接近無菌的空間，通常認(rèn)為，其燈芯上方的火焰旁邊5 cm范圍內(nèi)為無菌區(qū)，如圖4所示。所以，操作應(yīng)在此范圍內(nèi)進(jìn)行為最好，例如，打開的試管口和瓶口保持對(duì)著火焰，可以防止外界的微生物落入。據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)可知，常規(guī)的無菌操作保持在火焰旁邊3～5 cm范圍內(nèi)進(jìn)行是可行的，例如，菌種斜面轉(zhuǎn)接時(shí)試管(18 cm×18 cm)管口可保持在火焰旁邊3 cm范圍內(nèi)操作，倒平板時(shí)三角瓶瓶口(廣口250 ml)可放在火焰旁邊5 cm范圍內(nèi)操作。通過明確操作位置與火焰的距離，學(xué)生在操作過程中可以度量管口或接種環(huán)的停放位置是否越出范圍，從而及時(shí)改正。不過，對(duì)于初學(xué)者來說，由于動(dòng)作生疏，難免顧此失彼，操作中有時(shí)偏離了酒精燈火焰旁邊，因此，樹立“無菌操作范圍”的觀念有一個(gè)過程，需要老師多予提醒，通過強(qiáng)化觀念，練習(xí)動(dòng)作，逐漸養(yǎng)成知行合一的規(guī)范操作。

圖4 酒精燈火焰旁邊接近無菌的空間示意圖

2.3 接種環(huán)等金屬工具的滅菌應(yīng)灼燒至必要長度

在教學(xué)內(nèi)容中增加接種環(huán)灼燒滅菌的操作說明：1)豎提接種環(huán)將環(huán)端倒置于火焰中灼燒至發(fā)紅；2)斜置接種環(huán)來回灼燒鎳鉻絲段；3)延伸來回灼燒金屬桿前段，并轉(zhuǎn)動(dòng)使各處均勻過火，如圖5所示；4)滅菌后的接種環(huán)鎳鉻絲段停放于火焰旁邊的無菌區(qū)。另外，在教學(xué)中還要說明這樣做的原因，是因?yàn)樯烊朐嚬苤械牟糠?包括金屬桿前段)必需灼燒徹底滅菌，以防范在刮取菌種和接入菌種過程中桿上的雜菌飄落管內(nèi)造成污染。學(xué)生弄清原因之后，就會(huì)判斷自己應(yīng)該灼燒接種環(huán)到什么位置，進(jìn)而懂得以后在使用解剖刀等金屬工具時(shí)也需要灼燒至必要長度來防范污染。

圖5 接種環(huán)的滅菌應(yīng)灼燒至金屬桿前段

2.4 管口滅菌使用比較安全、有效的做法

帶棉塞的管口應(yīng)該怎樣灼燒滅菌？筆者開展了探索，結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)摸索出了比較可靠的手法。觀察可以看出，將管口伸到酒精燈火焰上方時(shí)，外焰火苗長且飄動(dòng)容易引燃棉塞，而中部的火焰較為穩(wěn)定適宜管口停留。以左手掌心朝上拿起一支試管，移管口靠近中部火焰左側(cè)旁邊，一邊以拇指向右捻轉(zhuǎn)試管，一邊通過手臂拉伸使管口來回過火2周，從而使管口得到均勻、充分地灼燒，如圖6所示。由于能穩(wěn)妥控制棉塞與火焰的距離，且在轉(zhuǎn)動(dòng)中灼燒，因而棉塞不容易被引燃。學(xué)生運(yùn)用這樣的手法灼燒管口，充分滅菌后再拔棉塞，即可順利完成操作。類似做法也適用于使用大棉塞的三角瓶，在倒平板時(shí)右手握瓶底左手托舉瓶身，斜伸瓶口到酒精燈火焰中部左側(cè)，轉(zhuǎn)動(dòng)瓶口灼燒2圈之后移位灼燒上下部分，然后再拔棉塞，這樣的操作穩(wěn)當(dāng)安全。對(duì)于使用硅膠塞的試管、三角瓶也可以采用這種做法，進(jìn)行管口、瓶口滅菌。這一做法可規(guī)范學(xué)生的操作，彌補(bǔ)此前該操作難以形成規(guī)范要求的不足，使操作全程有較為明確、可行的規(guī)范要求，便于教與學(xué)。

初學(xué)無菌操作時(shí)，學(xué)生著重于對(duì)動(dòng)作的模仿，對(duì)于為什么這樣做認(rèn)識(shí)不足，理解有限，遇到使用棉塞等與教材不同的實(shí)驗(yàn)器材或變化的實(shí)驗(yàn)條件時(shí)難免無所適從。因此，在示教時(shí)老師需要有“庖丁解?！钡囊庾R(shí)將連貫操作分解為單項(xiàng)動(dòng)作，演示不能過快，同時(shí)講清楚做動(dòng)作的目的以及做到的程度，使學(xué)生看清楚動(dòng)作，聽明白要求，并通過反復(fù)練習(xí)、體會(huì)，理解無菌操作的基本原則和要求，熟練操作；這樣，今后學(xué)生在面對(duì)變化的實(shí)驗(yàn)器材時(shí)就懂得設(shè)計(jì)操作動(dòng)作，靈活地運(yùn)用各種無菌操作技術(shù)進(jìn)行應(yīng)對(duì)。

圖6 在火焰中部旁邊灼燒管口滅菌的操作示意圖

3 操作步驟的重新歸納

由于采用與教材不同的管口灼燒滅菌做法，使前后的操作產(chǎn)生了相應(yīng)的變化，教材上的操作步驟有不適合地方，因此，針對(duì)廣西師范大學(xué)在微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中菌種斜面通常使用棉塞的情況，本文歸納形成新的斜面接種操作步驟供教學(xué)參考，并作為教材內(nèi)容的補(bǔ)充；在步驟中對(duì)易造成污染的細(xì)節(jié)增加了注意提示。具體有如下4個(gè)步驟。

1)右手拇指與食指、中指相對(duì)拿捏接種環(huán)的金屬桿后端，提起接種環(huán)進(jìn)行火焰灼燒滅菌，使環(huán)端倒置于火焰中灼燒至發(fā)紅，再斜置接種環(huán)來回灼燒鎳鉻絲段，然后延伸來回灼燒金屬桿前段，并轉(zhuǎn)動(dòng)使各處均勻過火，如圖5所示。滅菌后的接種環(huán)停放于火焰旁邊。注意：接種環(huán)伸入試管中的部分(包括金屬桿前段)必須灼燒徹底滅菌。

2)左手掌心朝上拇指與其余四指相對(duì)拿捏待接種斜面試管后端，管口朝前略為上傾移近酒精燈火焰中部左側(cè)，一邊以拇指向右捻轉(zhuǎn)試管一邊通過手臂拉伸使管口來回過火，灼燒塞入部位至棉塞露空部分，轉(zhuǎn)動(dòng)2周均勻灼燒，如圖6所示。移動(dòng)該管入虎口以拇指根部壓住，然后拿起菌種斜面試管以同樣手法灼燒管口滅菌。

3)左手指推移菌種斜面試管后端使試管轉(zhuǎn)為橫向，管口位于火焰正前方，斜面朝上，食指鉤住待接種試管；右手掌心朝上拿捏接種環(huán)，將環(huán)圈至金屬桿前段快速過火一個(gè)來回，然后以手掌邊緣夾住棉塞拔出，將接種環(huán)小心伸入菌種斜面試管的上半部(此時(shí)不要接觸斜面培養(yǎng)物)，至少冷卻10 s后，輕壓環(huán)圈平貼菌苔刮起少許培養(yǎng)物(可停頓觀察，環(huán)圈附有粘稠物顯得濕潤應(yīng)是刮有菌)，如圖3所示；退出接種環(huán)，將管口、棉塞分別在火焰上快速繞圈燒一下然后塞入，就近放菌種試管在酒精燈旁邊的矮小擱架上(可用細(xì)鐵絲自制“工”形小擱架)。注意：以掌心朝上的手勢操作，拔棉塞、刮菌、塞棉塞應(yīng)保持管口在火焰旁邊3～5 cm范圍內(nèi)進(jìn)行，棉塞不能放在桌上；接種環(huán)伸入試管前最好快速過火一下，以燒死停放期間可能飄落的雜菌。

4)左手指推移待接種斜面試管轉(zhuǎn)為橫向，管口位于火焰正前方，右手迅速夾住棉塞并拔出，將接種環(huán)小心放進(jìn)試管斜面的底部并從下向上劃一直線，然后再從底部開始向上作蛇形劃線接種。完畢后，將管口、棉塞分別燒一下然后塞入放回試管架；斜置接種環(huán)灼燒環(huán)端殺滅余菌，并延伸灼燒其他部位，徹底滅菌后將接種環(huán)斜放火焰旁邊待接下一管。注意：接種環(huán)不要碰到試管口邊；拔棉塞、劃線接種、塞棉塞要保持管口在火焰旁邊3～5 cm范圍內(nèi)操作。

斜面接種通常需要從一支菌種轉(zhuǎn)接多支斜面，可以在步驟4)之后這樣操作：左手拿起一支待接種斜面以相同手法灼燒管口滅菌，再以食指鉤住該管，用其余四指捏住菌種斜面試管后端拿起并伸管口到火焰上方快速過火，然后翻腕使管口另一面也過火，橫置菌種試管使管口位于火焰正前方，之后銜接步驟3)、步驟4)完成轉(zhuǎn)接，通過操作循環(huán)即可快速轉(zhuǎn)接出多支斜面。

4 結(jié)束語

實(shí)踐表明，上述教學(xué)內(nèi)容的改進(jìn)可以增進(jìn)學(xué)生對(duì)無菌操作要求的理解，減少錯(cuò)誤，動(dòng)作更加到位、規(guī)范，實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果獲得提升。由于目的或材料不同，微生物實(shí)驗(yàn)中無菌操作的具體步驟有所差異，但原則和基本動(dòng)作是一致的，因此，該實(shí)驗(yàn)奠定的良好基礎(chǔ)能起到觸類旁通的作用，此后學(xué)生學(xué)習(xí)倒平板、微生物制片、微生物分離及純化等其它無菌操作步驟就更加容易理解、掌握。本文整理的使用棉塞的菌種斜面的轉(zhuǎn)接操作步驟適合教學(xué)實(shí)際，步驟中對(duì)平常將管口伸到酒精燈火焰上方灼燒滅菌的做法加以改進(jìn)，改在中部火焰左側(cè)一邊捻轉(zhuǎn)試管一邊拉伸管口來回過火，使管口充分均勻灼燒，而棉塞不易被引燃，既保證了管口滅菌的效果，又保障了操作安全。由于每次是單管操作，可使菌種斜面、待接種斜面的管口都得到充分灼燒滅菌，因而可以減少污染，提高轉(zhuǎn)種成功率。該操作在實(shí)驗(yàn)課前菌種準(zhǔn)備、菌種轉(zhuǎn)管擴(kuò)繁和菌種保藏等需要轉(zhuǎn)接較多斜面的工作中具有實(shí)用意義。

前些年，廣西師范大學(xué)使用的教材是沈萍、范秀容、李廣武主編的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(第3版)，書中介紹斜面接種是以左手同時(shí)拿著菌種斜面試管和待接斜面試管開展操作[13]，在教學(xué)中發(fā)現(xiàn)學(xué)生一只手掌控兩支試管進(jìn)行操作不夠便利：在管口灼燒滅菌時(shí)，兩支管口靠近且擔(dān)心棉塞被引燃，因而管口側(cè)面未能做到充分灼燒滅菌；在火焰旁邊對(duì)一支管口刮菌或接入菌時(shí)另一支管口往往偏離火焰旁邊；右手夾持的兩個(gè)棉塞在回塞一個(gè)時(shí)另一個(gè)棉塞因也靠近火焰稍不留意即被點(diǎn)燃。而本文整理的操作步驟克服了以上不足，對(duì)菌種斜面、待接種斜面試管分別單獨(dú)開展管口灼燒滅菌、取菌或接入菌，塞棉塞等操作，因單支試管更易于掌控，從而使操作順暢、動(dòng)作到位，降低了污染風(fēng)險(xiǎn)。該操作步驟對(duì)斜面接種的無菌操作技術(shù)提出了一種有益的改進(jìn)方法。