投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚生長和肝臟健康的影響

劉 偉， 文 華， 蔣 明， 吳建軍， 吳 凡， 田 娟， 陸 星，喻麗娟

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護重點實驗室， 武漢 430223；2.武漢新華揚生物科技有限公司， 武漢 430074)

投飼技術(shù)是魚類養(yǎng)殖成功與否的關(guān)鍵因素。投飼技術(shù)包括投喂率、投喂頻率、投喂節(jié)律和投喂地點等。其中，投喂率和投喂頻率對魚類的生長和飼料利用效率影響最為顯著[1]。一般認為，適宜的投喂頻率可以促進魚類的生長，降低魚類個體分化，提高存活率和飼料利用率，減少殘餌和代謝廢物排放對養(yǎng)殖環(huán)境的污染[2]。適宜的投喂率在最大限度滿足魚類正常生長的同時也可以節(jié)約飼料成本[3]。同時，投喂率[4]和投喂頻率[5]也會對魚類健康產(chǎn)生影響。因此，尋求最佳的投喂率和投喂頻率是水產(chǎn)養(yǎng)殖成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

羅非魚是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)向全世界推廣的優(yōu)良水產(chǎn)養(yǎng)殖對象。自2011年以來，我國的養(yǎng)殖產(chǎn)量一直穩(wěn)定在140萬噸以上，位居世界首位。研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚的投喂率或投喂頻率隨體重的增加而降低[6-8]。但是，受到實驗環(huán)境、飼料質(zhì)量、養(yǎng)殖品種或品系等因素的影響，即使相同規(guī)格的羅非魚，其適宜投喂率或投喂頻率的研究結(jié)果差異明顯。如在封閉循環(huán)系統(tǒng)中養(yǎng)殖的初始體重60 g的奧利亞羅非魚(Oreochromiscoaureus)，其最適投喂率僅為2%[9]，而在水泥池網(wǎng)箱中養(yǎng)殖的初始體重72 g的吉富羅非魚(GIFT，Oreochromisniloticus)，其投喂率可達6.21%[10]。早期推薦適宜水溫下5～25 g的羅非魚，最佳投喂率為4%，最佳投喂頻率為4次/d[11]；但最近對體重5～16 g的吉富羅非魚的研究則發(fā)現(xiàn)，最佳投喂率為6%，最適投喂頻率為2次/d[7]。此外，有關(guān)投喂率和投喂頻率對羅非魚生理健康影響方面的研究報道也較少。吉富羅非魚是經(jīng)過遺傳性狀改良后的尼羅羅非魚，其生長速度較其他品系快5%～20%[12]，是我國羅非魚養(yǎng)殖中主要養(yǎng)殖品系之一，其養(yǎng)殖面積曾占我國羅非魚養(yǎng)殖面積的60%以上[13]。因此，本研究以吉富羅非魚為研究對象，通過研究不同投喂率和投喂頻率對其生長、飼料利用、體成分、肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)和部分生理生化指標的影響，探討投飼技術(shù)對羅非魚生長和健康的影響，以期為羅非魚飼料的合理使用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以豆粕、菜粕、魚粉等為原料，配制成蛋白水平為33.5%，脂肪水平為6.9%的實用配方飼料(配方見表1)。將各種原料粉碎，過60目篩，按飼料配方稱重后充分混勻，利用小型絞肉機制成直徑為2 mm 的成品飼料，自然風干，破碎后，置于- 20℃冰箱中儲藏備用。

1.2 實驗魚

實驗魚來源于湖北省羅非魚原良種場。運回后，暫養(yǎng)在4個直徑1 m (有效容積400 L)的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，使實驗魚恢復(fù)體質(zhì)，并適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。暫養(yǎng)期間每天表觀飽食投喂2次(8∶30和16∶30)實驗飼料。2周后，選擇規(guī)格整齊，表觀健康的720尾魚，隨機分養(yǎng)于24個循環(huán)水養(yǎng)殖桶中(有效容積100 L)，每桶放魚30尾。實驗魚的平均體質(zhì)量(3.78±0.01) g。

1.3 實驗設(shè)計和飼養(yǎng)管理

采用2×4雙因子實驗設(shè)計，共計8個處理組，每個處理組設(shè)置3個重復(fù)。依據(jù)資料[6，15-16]，本研究的投喂頻率(FF)設(shè)定為2次/d(8∶30和16∶30)和3次/d(8∶30，12∶30和16∶30)。在前期的馴養(yǎng)階段發(fā)現(xiàn)，實驗魚采用表觀飽食投喂，每天投喂2次，每次投喂15 min，通過計算可得每日的投喂率(FR)約為10%。據(jù)此，投喂率設(shè)定為8%，10%，12%和表觀飽食投喂。在投喂過程中，根據(jù)投喂頻率，平均分配每次的投喂量，每次投喂30 min。實驗持續(xù)30 d。每隔10 d稱重1次，以每個處理的平均體質(zhì)量和成活率，并根據(jù)投喂率調(diào)整投喂量。養(yǎng)殖期間采用自然光照，水流2 L/(min·桶)，水溫(30.1±0.6) ℃，溶解氧>5 mg/L、氨氮濃度<0.5 mg/L、pH6.8～7.5。

表1 飼料配方及營養(yǎng)組成Tab.1 Formulation and nutrient composition of the diet

1.4 樣品制備、分析和指標計算

實驗開始20 d后，在羅非魚排便高峰期的20∶00～21∶00，用密網(wǎng)撈取并挑選條狀成型、飽滿的糞便，放入培養(yǎng)皿中，在-40 ℃的冰箱中冷凍后，放入真空冷凍干燥機中，冷凍干燥72 h。取出，粉碎過45目篩，放入樣品袋中，于-40 ℃的冰箱中保存。每天收集糞便1次，直至收集的糞便足夠分析為止。

實驗結(jié)束后，禁食24 h，麻醉(MS-222，150 mg/L)后，對每桶實驗魚進行計數(shù)和稱體質(zhì)量。每桶隨機取魚3尾，測量體長和體質(zhì)量，用于計算肥滿度；并于尾靜脈取血，混合后于4 ℃冰箱內(nèi)靜置2 h，以3 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心15 min，得到空腹血清，保存于-80 ℃冰箱中，用于測定血清生化指標；隨后取肝臟、內(nèi)臟并稱重，用于計算肝體比、臟體比；取同一部位的部分肝臟，放于4%多聚甲醛溶液中，用于檢測肝臟組織結(jié)構(gòu)。去內(nèi)臟全魚、肝臟和內(nèi)臟分別保存于-20 ℃冰箱中，用于測定常規(guī)營養(yǎng)成分。另每桶隨機撈魚3尾，取其背鰭以下側(cè)線以上的肌肉，保存于-20 ℃冰箱中，用于測定常規(guī)營養(yǎng)成分。

測定方法：直接干燥法測定水分含量(GB/T 5009.3-2003)；凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量(GB/T5009.5 - 2003)；索氏抽提法測定粗脂肪含量(GB/T 5009.6- 2003) ；灼燒稱重法測定灰分含量(GB/T 5009.4- 2003)；電感耦合等離子質(zhì)譜法測定Y2O3含量(GB/T 18115.1)。

使用日本希森美康(CHEMIX -800)全自動生化分析儀測定8種血清生化指標：總蛋白(TP)、球蛋白(ALB) 、堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血糖(GLU)、甘油三酯(TGK) 和總膽固醇(TCHO)。

肝組織標本固定后石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，光鏡下逐片觀察及照片，運用圖像分析軟件(Image Pro Plus 6.0)對HE染色結(jié)果進行處理。每塊組織隨機選擇4張照片進行分析。

其余各指標的計算公式如下：

增重率 (WG)=(W1-W0)/W0×100%；

特定生長率 (SGR)= (lnW1-lnW0)/t×100%；

飼料效率 (FE)= (Wf-Wi+Wd)/WA；

蛋白質(zhì)效率 (PER)= (Wf-Wi+Wd)×100% /Wp；

成活率 (SR)=Nf/Ni×100%；

肥滿度 (CF)=W/L3×100；

肝體比 (HSI)=WH/W×100%；

臟體比 (VSI)=WV/W×100%；

飼料成本 (FC)=WA×F/ (Wf-Wi+Wd)；

干物質(zhì)表觀消化率(AD)=100%×(1-Md/Mf)；

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(ADCd)=100%×[1-(Nf/Nd) ×(Md/Mf)]。

式中，t為實驗天數(shù)(d)，W0和W1分別為實驗魚的初、末均體質(zhì)量(g)，Wi、Wf和Wd、Wp分別為實驗魚的初、末總體質(zhì)量(g)、死亡魚的體質(zhì)量(g)和攝入飼料粗蛋白含量(g)，W為魚體質(zhì)量(g)，L為魚體長(cm)，WA為投喂飼料總質(zhì)量(g)，Ni和Nf分別為實驗結(jié)束后和開始時魚的尾數(shù)，WH、WV和W分別為肝胰臟、內(nèi)臟質(zhì)量和體質(zhì)量(g)，F(xiàn)為配方成本(元/kg)，Md為飼料中標記物含量(%)，Mf為糞便中標記物含量(%)，Nd為飼料中營養(yǎng)成分的含量(%)，Nf為糞便中營養(yǎng)成分的含量(%)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 生長和飼料利用

投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚生長和飼料利用的影響見表2。由表2可見，投喂率和投喂頻率對實驗魚的平均末體質(zhì)量、增重率(WG)、特定生長率(SGR)和肝體比存在顯著的交互作用。投喂率由8%增加到12%時，實驗魚的WG、SGR和飼料成本顯著升高。表觀飽食組實驗魚的WG和SGR顯著高于投喂率為8%的，而與其他組差異不顯著；但其飼料效率(FE)和蛋白質(zhì)效率(PER)與投喂率為8%組的差異不顯著，顯著高于其他組。隨投喂率由8%增加到12%，飼料成本(FC)增加，實驗魚的成活率逐漸升高。投喂率為12%組的FC顯著高于其他組，表觀飽食投喂組的FC最低，但與8%和10%投喂率組的差異不顯著，而顯著低于12%投喂率組。投喂率和投喂頻率對實驗魚的肥滿度和臟體比無顯著影響，但對肝體比影響顯著。投喂率為8%組實驗魚的肝體比顯著小于投喂率為10%組的，而與其他組差異不顯著。由表2亦可見，投喂率和投喂頻率對實驗魚的表觀消化率的影響不顯著，但隨投喂頻率的增加，表觀消化率有改善的趨勢。

表2 投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚生長和飼料利用的影響Tab.2 Effects of feeding frequency and feeding level on growth performance and feed utilization of GIFT tilapia

注：表中值為平均值±標準差(n=3)，同列數(shù)據(jù)肩標小寫字母不同，表示差異顯著(P<0.05)。APD，飼料粗蛋白表觀消化率。

2.2 體成分

投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚體成分的影響見表3。由表3 可見，僅發(fā)現(xiàn)投喂率對實驗魚的肝臟粗脂肪，以及去內(nèi)臟全魚的水分和粗脂肪具有顯著影響；而投喂頻率對體成分無顯著影響。增加投喂率使得肝臟粗脂肪和去內(nèi)臟全魚的粗脂肪含量增加，而去內(nèi)臟全魚水分含量逐漸降低。表觀飽食投喂組實驗魚的肝臟粗脂肪和去內(nèi)臟全魚水分含量與其他組差異不顯著，但其去內(nèi)臟全魚粗脂肪含量顯著高于投喂率為8%組，而與其他組差異不顯著。

表3 投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚體成分的影響Tab.4 Effects of feeding frequency and feeding level on body composition of GIFT tilapia% 濕重

2.3血清生化指標

投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚血清生化指標的影響見表4。由表4可見，投喂率對血清的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性(AST)和血糖水平有顯著影響，而投喂頻率僅對血糖水平有顯著影響。10%投喂率組實驗魚的血清AST活性顯著高于投喂率8%組的。隨投喂率的增加，血糖水平逐漸增加，表觀飽食投喂組的血糖水平與10%和12%組差異不顯著，但顯著高于8%投喂組；隨投喂頻率的增加，血糖水平降低。投喂率和投喂頻率對血糖水平存在交互作用。

表4 投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚血清生化指標的影響Tab.4 Effects of feeding frequency and feeding level on serum biochemical indexes of GIFT tilapia

2.6 肝臟組織結(jié)構(gòu)

在本實驗中，各處理組實驗魚的肝細胞結(jié)構(gòu)基本正常，細胞膜和細胞核清晰可見，所有處理組均發(fā)現(xiàn)有細胞核偏移和空泡現(xiàn)象，但未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞膜溶解及炎癥細胞浸溶等病理現(xiàn)象。投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚肝組織形態(tài)的影響見表5。由表5可知，投喂率和投喂頻率對實驗魚肝細胞核的面積比例無顯著影響，但對其肝細胞空泡、細胞質(zhì)面積比例有顯著影響。隨投喂率的增加，實驗魚肝臟空泡面積比例有增加的趨勢，表觀飽食組實驗魚的肝臟空泡面積最高，而細胞質(zhì)面積最小。投喂率為8%，投喂頻率為2次/d實驗魚的肝細胞空泡和細胞質(zhì)面積比例與表觀飽食投喂3次/d之間差異顯著。

表5 投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚肝組織形態(tài)的影響Tab.5 Effects of feeding frequency and feeding level on liver structure of GIFT tilapia

3 討論

3.1 投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚生長性能和飼料利用的影響

本實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)表觀飽食投喂3次/d實驗魚的飼料效率最佳，但其生長性能與飼料成本均與投喂率為10%實驗魚的無顯著差異(表2)，表明以10%的投喂率，投喂 2次/d是適合吉富羅非魚幼魚生長的。在本實驗中，隨投喂率和投喂頻率的增加，實驗魚的生長性能得到提高，這與小丑魚(Amphiprionpercula)[17]、大蓋巨脂鯉(Colossomamacropomum)[18]的研究結(jié)果類似。但在8%～12%的投喂率下，投喂頻率未影響實驗魚的生長，這與已有羅非魚的研究類似[7，19]，表明羅非魚的生長依賴于食物的攝入量[2]。本實驗中，表觀飽食投喂3次/d具有較佳的生長性能和飼料利用效率，推測原因是每餐進行表觀飽食投喂，實驗魚每餐均可根據(jù)其生理需要保持最佳攝食量，從而更利于其生長并節(jié)約飼料。

隨投喂率由8%增加到12%，實驗魚的飼料效率逐漸降低，這與尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的研究結(jié)果類似[20]，表明魚類的攝食量及消化吸收有一定限度，即存在一個最適和最經(jīng)濟的投喂率，過高不但不會獲得最佳的生長速度，而且會造成飼料的浪費，增加養(yǎng)殖成本[3]。表觀飽食投喂組的飼料效率與投喂率為8%組的差異不顯著，但高于投喂率為10%和12%組，這與雜交斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus×I.furcatus)的研究結(jié)果類似[21]，表明表觀飽食投喂更利于飼料利用和節(jié)約成本。在本實驗中，實驗魚對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率未受投喂率和投喂頻率的影響，類似的研究結(jié)果在投喂率和投喂頻率對大西洋鮭(Salmosalar)的影響研究中也有所發(fā)現(xiàn)[22]。這可能與本實驗的投喂率與其最適生長所需的較為接近所致。Sajjadi[23]在對大西洋鮭(Salmosalar)適宜投喂率的研究中發(fā)現(xiàn)，與維持最大生長投喂率的實驗魚相比，相近的投喂率并未影響生長和營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率；同時，Xie等[24]也發(fā)現(xiàn)表觀飽食的尼羅羅非魚與相近的投喂量之實驗魚的生長，以及飼料粗蛋白、能量等的表觀消化率無顯著差異。

肝體比、臟體比和肥滿度是評價魚類營養(yǎng)生理狀況的常用指標[25]。本實驗中，投喂頻率3次/d實驗魚的肝體比顯著高于投喂2次/d的，且本實驗中投喂率為10%組實驗魚的肝體比顯著高于8%投喂率組的，這是因為肝臟作為魚類的營養(yǎng)物質(zhì)代謝的主要器官，提高投喂率和投喂頻率增加了營養(yǎng)物質(zhì)的積累[25]，造成了肝臟重量增加，進而肝體比提高。本實驗中，實驗魚在投喂率由8%升高至12%時的成活率有不顯著的升高，但是投喂率為8%的實驗魚的成活率顯著低于表觀飽食投喂組，這可能與低投喂率下，魚類的免疫力受到抑制，造成成活率偏低有關(guān)[26]。

一般來說，魚體成分中的脂肪和水分呈相反關(guān)系，蛋白質(zhì)含量相對穩(wěn)定[25]。本實驗中投喂頻率和投喂率對羅非魚肝臟、肌肉、去內(nèi)臟全魚及內(nèi)臟粗蛋白質(zhì)含量均無顯著影響。但隨投喂率的增加，去內(nèi)臟全魚和肝臟水分含量有降低趨勢，粗脂肪含量有升高趨勢，這與攝食量的增加，造成了能量物質(zhì)的攝入增加，進而轉(zhuǎn)化成脂肪含量有關(guān)。

3.2 投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚肝臟健康的影響

血液可以客觀反映養(yǎng)殖動物的營養(yǎng)代謝狀況，是重要的生理學(xué)、病理學(xué)和毒理學(xué)指標，對于研究機體新陳代謝和生理狀況具有重要意義[27]。當肝臟病變而引起細胞通透性增加，或受損傷的范圍較大時，細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶大量釋放出來進入血漿，血液中ALT與AST活性升高[28]。但是，在正常代謝過程中，血清中 AST 和 ALT 活性值也會維持一定水平，它們活性高低同時也反映了蛋白質(zhì)合成和分解代謝的狀況[29]。本實驗中，各處理組間血清AST并無顯著差異，但是固定投喂率時發(fā)現(xiàn)，10%投喂率組實驗魚的血清AST活性要高于8%投喂率組的，而這兩組間在數(shù)值上僅相差11 U/L，同時，在進行切片觀察時，也未發(fā)現(xiàn)肝細胞有損傷或融合的現(xiàn)象，因此，這需要進一步研究不同投喂率下羅非魚的蛋白質(zhì)代謝水平。

肝臟在糖代謝和血糖調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。當機體能量充足時，從消化道吸收的過多血糖以糖原形式儲存于肝臟內(nèi)；饑餓或禁食狀態(tài)下，肝內(nèi)糖原被分解并磷酸化為6-磷酸葡萄糖，再在葡萄糖-6-磷酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為葡萄糖釋放入血，供機體能量代謝[30]。在本實驗中，投喂率的提高使得血糖水平升高，類似的結(jié)果在對團頭魴(Megalobramaamblycephala)[5]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[31]的研究中都有所發(fā)現(xiàn)，表明魚類的碳水化合物的消化或代謝增加[26]。

覃希[7]對吉富羅非魚幼魚的觀察發(fā)現(xiàn)，投喂率為6%的實驗魚(實驗?zāi)w質(zhì)量約20 g)肝臟空泡面積小于投喂率為8%和10%的實驗室。但在本實驗中發(fā)現(xiàn)，投喂率8%～12%的實驗魚間未發(fā)現(xiàn)顯著的差異，而表觀飽食投喂組肝細胞的空泡面積比例較高。通常認為，空泡含有脂質(zhì)和糖原，這與肝臟的正常代謝功能有關(guān)[32]。一些研究表明，肝臟中脂質(zhì)和糖原沉積的升高是一種真正的營養(yǎng)病理，并可導(dǎo)致進行性器官病變[33]，對魚的健康造成不良影響[34]。然而，在本實驗中，有關(guān)肝臟健康狀況評價的血清指標，如TP、ALB、ALT、TCHO和TG，各組間并未顯現(xiàn)出明顯的差異，這似乎表明實驗結(jié)束時魚的肝臟健康狀況尚比較穩(wěn)定，造成空泡面積增大的原因應(yīng)該是實驗魚的生理適應(yīng)[35]，但這也同時預(yù)示著長期表觀飽食投喂，可造成肝臟營養(yǎng)負荷過重。

綜上所述，在本實驗條件下，以生長和飼料利用為判斷指標，吉富羅非魚采用表觀飽食投喂3次/d時，可以獲得最佳的生長性能和飼料利用效率，但會產(chǎn)生體脂肪積累過多，肝臟細胞空泡增大等影響；若綜合考慮生長和養(yǎng)殖成本，以10%的投喂率，投喂2次/d為宜。