外源6-BA對(duì)紫花苜蓿盛花期葉片光合、生理特性及結(jié)莢率的影響

宋佳琦，王玉祥，張 博

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 / 新疆西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052）

光合作用是植物生命活動(dòng)的核心反應(yīng)，是光化學(xué)同化物積累、轉(zhuǎn)運(yùn)的前提，是植物形成有效產(chǎn)量的保障。在經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，外源激素對(duì)植物光合作用有重要調(diào)控作用，其中細(xì)胞分裂素促進(jìn)光合作用的進(jìn)行，增加葉片內(nèi)葉綠素蛋白的合成，減少葉綠素的降解，促進(jìn)葉綠體中基粒的形成，影響葉綠體基因的表達(dá)和葉綠體DNA的合成[1-2]。外源細(xì)胞分裂素可以減輕植物葉片衰老，促進(jìn)抗衰基因的表達(dá)，使植物組織中信使RNA含量升高，保護(hù)RuBp羧化酶的結(jié)構(gòu)，使植物的光合作用可以順利進(jìn)行[3-4]。6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine, 6-BA)是細(xì)胞分裂素的一種，其生物活性強(qiáng)，可有效延緩植物葉片衰老，提高葉片中抗氧化酶活性，及時(shí)清除葉片內(nèi)過(guò)多的自由基[5-6]，提高葉片的凈光合速率、葉綠素含量，并減小葉片氣孔阻力[7]。外源6-BA提高葉片光合能力不僅與氣體交換參數(shù)相關(guān)，與光合機(jī)構(gòu)中光合電子傳遞鏈也相關(guān)，幫助光合電子順利傳遞，減輕光合機(jī)構(gòu)的損傷程度[8-10]。外施6-BA還可提升大豆(Glycine max)[11]、羽扇豆(Lupinus micranthus)[12]、水稻(Oryza sativa)[13]等經(jīng)濟(jì)作物的結(jié)實(shí)率及種子產(chǎn)量，對(duì)植物的開(kāi)花結(jié)實(shí)有重要影響。

紫花苜蓿(Medicago sativa)為簇生總狀的無(wú)限花序，小花數(shù)量龐大，但種子產(chǎn)量低。目前有關(guān)紫花苜蓿種子生產(chǎn)的研究，多數(shù)集中于栽培措施方面，但紫花苜蓿種子產(chǎn)量依然較低。紫花苜蓿生殖生長(zhǎng)過(guò)程中，光合作用的順利進(jìn)行有利于光化學(xué)同化物的產(chǎn)生和積累，為生殖器官的生長(zhǎng)發(fā)育提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，防止因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺失導(dǎo)致小花敗育及花莢的脫落，從而影響種子產(chǎn)量。通過(guò)葉面噴施乙烯利、多效唑增加了紫花苜蓿單位面積花序數(shù)、單位面積結(jié)莢花序數(shù)和每花序莢果數(shù)，提升了潛在種子產(chǎn)量[14-15]，表明施用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可影響苜蓿的種子產(chǎn)量。王玉祥[16]研究激素與水肥對(duì)苜蓿生殖生長(zhǎng)和種子產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，在苜蓿盛花期噴施不同濃度的6-BA、 赤 霉 素 (Gibberellin, GA)和 生 長(zhǎng) 素 (Auxin,IAA)，對(duì)苜蓿的結(jié)莢率和種子產(chǎn)量有不同程度的影響，適宜濃度的6-BA可提高種子產(chǎn)量，但未從植物生理層面探討影響苜蓿種子產(chǎn)量的原因?；诖耍狙芯恳孕履?號(hào)紫花苜蓿為試驗(yàn)材料，現(xiàn)蕾期噴施不同濃度6-BA，探討外源6-BA對(duì)苜蓿盛花期葉片光合作用、抗氧化系統(tǒng)及結(jié)實(shí)性的影響，以期為細(xì)胞分裂素在苜蓿生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為新牧4號(hào)紫花苜蓿(Medicago sativa‘Xinmu No.4')，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)“西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)”省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)處理

于2017年5至7月在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)三坪農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)站進(jìn)行田間試驗(yàn)，2016年秋季播種，行距60 cm，播量 30 kg·hm-2，播深 1～2 cm，采用地下滴灌的方式進(jìn)行灌溉，試驗(yàn)期間進(jìn)行正常的田間管理。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，在苜蓿返青期選取生長(zhǎng)狀況一致的地塊劃分小區(qū)，小區(qū)面積 15 m2(3 m × 5 m)，試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。苜?，F(xiàn)蕾期用手持噴霧器噴施人工合成細(xì)胞分裂素(6-BA)，6-BA 濃度設(shè)置為 10、20 和 30 mg·L-1，清水為對(duì)照。為了使6-BA能更好地附著在葉片，6-BA溶液及清水均含0.5%的吐溫-20，噴灑量為每個(gè)小區(qū)2 L溶液，噴施時(shí)間為08:00和20:00，每天噴施2次，連續(xù)噴施 3 d。

1.3 測(cè)定內(nèi)容與方法

在苜蓿盛花期隨機(jī)選取功能葉測(cè)定光合參數(shù)和熒光參數(shù)，每個(gè)參數(shù)測(cè)定10次重復(fù)。同一時(shí)間隨機(jī)選取相同葉位的苜蓿葉片，放在錫箔紙內(nèi)包裹好，迅速放入液氮中，速凍24 h，然后將樣品轉(zhuǎn)入-40 ℃的冰箱內(nèi)，用于測(cè)定生理指標(biāo)。

1.3.1 光合參數(shù)的測(cè)定

天氣晴朗時(shí)用光合儀(型號(hào)：PP-SystemCRIAS-2)進(jìn)行測(cè)定，葉室溫度約為30 ℃，光照強(qiáng)度約為2 000 μmol·(m2·s)-1，CO2濃度 (Ca)約為 420 μmol·L-1，測(cè)定最大凈光合速率 [Pn，μmol·(m2·s)-1]、胞間 CO2濃度 (Ci， μmol·mol-1)、蒸騰速率 [Tr，μmol·(m2·s)-1]和葉片水分利用效率 (WUE，μmol·μmol-1)。

1.3.2 熒光參數(shù)的測(cè)定

天氣晴朗時(shí)用植物效率分析儀(型號(hào)：Handy-PEA)測(cè)定葉片快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線(O-J-I-P曲線)，測(cè)定時(shí)間為16:00(光照最強(qiáng))，測(cè)定前在葉片上夾上葉夾，在黑暗條件下適應(yīng)30 min后進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)用到熒光參數(shù)為：初始熒光(Fo)，以吸收光能為基礎(chǔ)的光化學(xué)性能指數(shù)(PIABS)，最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)，光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)。

1.3.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定，游離脯氨酸采用酸性茚三酮法測(cè)定，過(guò)氧化氫含量采用分光光度法測(cè)定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光下還原法測(cè)定，過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定[17]。

1.3.4 結(jié)實(shí)性觀測(cè)

單序小花數(shù)：在盛花期，各小區(qū)隨機(jī)選取30個(gè)花序，統(tǒng)計(jì)小花數(shù)量；單序莢果數(shù)：在完熟期，各小區(qū)隨機(jī)選取30個(gè)花序，統(tǒng)計(jì)莢果數(shù)量；千粒重：在收獲的種子中隨機(jī)數(shù)出1 000粒種子稱重，重復(fù)10次；單株種子產(chǎn)量：種子成熟后在各個(gè)小區(qū)中隨機(jī)選取10株苜蓿，每株單獨(dú)收獲拷種。

結(jié)莢率 = (單序莢果數(shù)/單序小花數(shù)) × 100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用Excel 2010錄入，Origin8.0作圖。采用SPSS 20.0軟件對(duì)種子產(chǎn)量、光合參數(shù)、熒光參數(shù)、抗氧化酶活性進(jìn)行單因素方差分析及Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源6-BA對(duì)苜蓿盛花期葉片光合參數(shù)的影響

10和 20 mg·L-16-BA處理后，苜蓿葉片 Pn、Tr、WUE 均顯著高于對(duì)照，Ci顯著 (P＜0.05)低于對(duì) 照 (圖 1)，20 mg·L-16-BA 處 理 后 Pn、Tr、WUE值最大，分別高于對(duì)照39.34%、17.99%和18.06%，Ci低于對(duì)照 7.11%。在 30 mg·L-16-BA 處理下，苜蓿葉片 Pn和 WUE分別顯著 (P＜0.05)低于對(duì)照2.94%和14.05%，Ci顯著高于對(duì)照6.33%。以上結(jié)果表明，10和20 mg·L-16-BA可提高苜蓿葉片的光合能力，提高葉片對(duì)CO2的利用率，減少細(xì)胞間隙CO2的積累。

2.2 外源6-BA對(duì)苜蓿盛花期葉片熒光參數(shù)的影響

初始熒光(Fo)是葉片在黑暗適應(yīng)下PSⅡ反應(yīng)中心完全開(kāi)放時(shí)的熒光產(chǎn)量，如圖2所示，隨著6-BA處理濃度遞增，F(xiàn)o逐漸減少，表明6-BA可降低葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)的損傷。最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)和光合性能指數(shù)(PIABS)可反映葉片光合機(jī)構(gòu)的損傷程度及光抑制程度，20 和 30 mg·L-16-BA 處理后，F(xiàn)v/Fm、PIABS和Fv/Fo均高于對(duì)照，表明外源6-BA可降低強(qiáng)光照射下葉片的光抑制程度，減小光合機(jī)構(gòu)的損傷程度。

2.3 外源6-BA對(duì)苜蓿盛花期葉片抗氧化酶活性的影響

30 mg·L-16-BA處理，葉片中SOD活性顯著高于 其 他 處 理 (P＜ 0.05)(圖 3)， 較 對(duì) 照 高 4.05%。10和20 mg·L-16-BA處理，顯著提高POD和 CAT活性。6-BA 濃度為 20 mg·L-1時(shí) POD 和 CAT 活性最強(qiáng)，分別高于對(duì)照5.62%和11.49%。說(shuō)明外源6-BA可增強(qiáng)苜蓿盛花期葉片抗氧化酶活性，減緩活性氧對(duì)光合器官的破壞。

2.4 外源6-BA對(duì)苜蓿盛花期葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和過(guò)氧化氫含量的影響

10 mg·L-1處理下，苜蓿盛花期葉片中可溶性

圖 1 不同濃度6-BA對(duì)苜蓿盛花期葉片光合參數(shù)的影響Figure 1 Changes of photosynthetic parameters of alfalfa at flowering stage under different concentrations of 6-BA

糖含量顯著高于其他處理 (P＜0.05)(圖4)，其次為20 mg·L-1和 30 mg·L-1處理。不同濃度 6-BA 均使葉片內(nèi)脯氨酸含量較對(duì)照顯著增多(P＜0.05)，20 mg·L-1處理下，脯氨酸含量最高，是對(duì)照的1.36倍。10和20 mg·L-1處理下葉片中過(guò)氧化氫含量顯著低于對(duì)照 (P＜0.05)，6-BA 濃度為 30 mg·L-1處理下，苜蓿葉片內(nèi)過(guò)氧化氫含量較對(duì)照高0.51 nmol·g-1。

2.5 外源6-BA對(duì)苜蓿結(jié)實(shí)性的影響

隨著6-BA濃度遞增，苜蓿的單序小花數(shù)逐漸增多，30 mg·L-1處理單序小花數(shù)最多，顯著高于對(duì)照(P＜0.05)(表1)；6-BA處理后苜蓿單序莢果數(shù)均顯著高于對(duì)照；20 mg·L-1處理最高；同樣在20 mg·L-1處理苜蓿結(jié)莢率最高 (57.06%)，顯著高于對(duì)照和 30 mg·L-1處理的。20 mg·L-1處理苜蓿種子千粒重顯著高于對(duì)照和 30 mg·L-1處理的，10 mg·L-1處理種子千粒重是對(duì)照的1.31倍，說(shuō)明10 mg·L-16-BA處理苜蓿種子較飽滿。不同濃度6-BA對(duì)苜蓿單株種子產(chǎn)量影響較大， 20 mg·L-16-BA，苜蓿單株種子產(chǎn)量最高，為5.73 g，是對(duì)照種子產(chǎn)量的1.11倍，比10 mg·L-1處理單株種子產(chǎn)量提高了 3.43%(P＞0.05)。以上分析表明，外源 6-BA 可提高苜蓿種子產(chǎn)量，20 mg·L-1處理最好，其次為10 mg·L-1。

3 討論

外源6-BA可提高植物光合速率在多種經(jīng)濟(jì)作物中已有研究報(bào)道，張海娜等[18]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10 mg·L-1的6-BA處理后，棉花(Gossypiumspp.)葉片Pn增加。經(jīng)6-BA處理后葡萄(Vitis vinifera)葉片的Pn及葉綠素含量升高，并且延長(zhǎng)葡萄葉片光合作用功能期[19]。在水分脅迫下，外施6-BA可以增強(qiáng)小麥(Triticum aestivum)的光合特性[20]。吳雪霞等[21]也發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下，外源6-BA可以增強(qiáng)茄子

圖 2 不同濃度6-BA對(duì)苜蓿盛花期葉片熒光參數(shù)的影響Figure 2 Changes of chlorophyll fluorescence parameters of alfalfa at flowering stage under different concentrations of 6-BA

圖 3 不同濃度6-BA對(duì)苜蓿盛花期葉片抗氧化酶活性的影響Figure 3 Changes of antioxidant enzyme activities in leaves of alfalfa at flowering stage under different concentrations of 6-BA

(Solanum melongena)幼苗光合能力，使茄子幼苗的Pn、Ci、Tr、Gs均有所提高。相關(guān)研究也表明，6-BA可影響植物葉片氣孔運(yùn)動(dòng)，增加葉片氣孔開(kāi)度，減小氣孔對(duì)CO2擴(kuò)散的阻力，同時(shí)提高RuBP羧化酶等光合作用相關(guān)酶的活性，促進(jìn)光合磷酸化反應(yīng)的進(jìn)行[22-23]。在本研究也發(fā)現(xiàn)，10和20 mg·L-16-BA 處理后，苜蓿葉片的 Pn、Tr、WUE 均高于對(duì)照，提高了苜蓿葉片的光合能力，并且促進(jìn)光合作用中CO2的吸收和利用。而30 mg·L-16-BA處理后，苜蓿葉片的Pn低于對(duì)照。植物葉片Pn下降的原因分為兩種情況，一是非氣孔限制因素，表現(xiàn)為Pn下降的同時(shí)伴隨Ci的升高；二是氣孔限制因素，表現(xiàn)為Pn下降的同時(shí)，Ci也隨之下降[24-25]。本研究中發(fā)現(xiàn)，6-BA 濃度為 30 mg·L-1的 處理下，苜蓿葉片Pn低于對(duì)照，Ci高于對(duì)照，表明葉片光合速率下降的原因主要為非氣孔限制因素，這可能與光化學(xué)活性限制、1,5-二磷酸核酮糖羧化限制和無(wú)機(jī)磷限制等因素，阻礙了CO2的利用，從而造成細(xì)胞間隙CO2積累，降低了該處理下苜蓿的光合速率。

圖 4 不同濃度6-BA對(duì)苜蓿盛花期葉片脯氨酸、可溶性糖及過(guò)氧化氫含量的影響Figure 4 Changes of proline, soluble sugar and hydrogen peroxide content in alfalfa during flowering stage under different concentrations of 6-BA

表 1 不同濃度6-BA對(duì)苜蓿結(jié)莢率的影響Table 1 Effect of different concentrations of 6-BA on alfalfa pod rate

葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)可以分析高等植物光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)內(nèi)部不同光電子傳遞過(guò)程中的變化和調(diào)控作用。在外源6-BA處理后可以顯著提高小麥旗葉的Fv/Fm、實(shí)際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)、光合電子傳遞速率(ETR)[26]。羅黃穎等[27]研究發(fā)現(xiàn)外施吡效隆(CPPU)和6-BA對(duì)鹽脅迫下番茄(Lycopersicon esculentum)葉片的葉綠素?zé)晒庥杏绊?，使番茄葉片主要熒光參數(shù)升高。張國(guó)斌等[28]也發(fā)現(xiàn)，在低溫弱光脅迫下辣椒(Capsicum annuum)幼苗經(jīng)6-BA處理后Fv/Fm、Fv/Fo等熒光參數(shù)有所提高。本研究中，噴施不同濃度6-BA使苜蓿葉片的Fo下降，F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo及PIABS升高；隨6-BA濃度上升，苜蓿葉片的Fo逐漸降低，表明6-BA可保護(hù)葉片類囊體膜結(jié)構(gòu)，減緩PSⅡ的反應(yīng)中心失去活性。不同濃度6-BA均使苜蓿葉片F(xiàn)v/Fm有不同程度的提升，說(shuō)明6-BA可減輕苜蓿葉片在光合作用時(shí)的光抑制程度，減緩因光能過(guò)剩而使光合電子不能繼續(xù)傳遞，對(duì)光合機(jī)構(gòu)有保護(hù)作用。

外源6-BA可提高油茶(Camellia oleifera)葉片SOD酶活性，減少葉片內(nèi)丙二醛(MDA)的積累，減輕油茶葉片膜脂過(guò)氧化作用[29]。經(jīng)外源6-BA處理后，能延緩離體雜交水稻葉片的衰老，促進(jìn)葉片內(nèi)抗氧化酶中的SOD、POD、CAT的活性增強(qiáng)，減少活性氧的積累[30]。獼猴桃(Actinidia chinensis)經(jīng)不同濃度6-BA處理后，葉片內(nèi)葉綠素降解變慢，SOD酶活性下降緩慢，膜透性減小，延緩葉片衰老[31]。植物組織中抗氧化酶活性較高，可及時(shí)清除自由基，減緩活性氧等物質(zhì)對(duì)光合機(jī)構(gòu)的破壞，促進(jìn)光合磷酸化反應(yīng)，提高光和電子傳遞效率，有利于光合作用的進(jìn)行。在本研究中，不同濃度6-BA均使苜蓿葉片內(nèi)SOD、POD、CAT酶活性增強(qiáng)，脯氨酸及可溶性糖含量高于對(duì)照，減少了葉片內(nèi)過(guò)氧化氫的積累，效果最佳的處理為20 mg·L-1的6-BA。

外源6-BA可提高植物的坐果率，增加產(chǎn)量，減少果實(shí)的脫落，張文學(xué)等[32]在齊穗期通過(guò)葉面噴施30 mg·kg-1的6-BA，發(fā)現(xiàn)6-BA可提高水稻的結(jié)實(shí)率，與對(duì)照相比提高3.85%，并且提高了種子的千粒重。在豇豆(Vigna unguiculata)、羽扇豆(Lupinus micranthus)、草地早熟禾(Poa pratensis)的研究中也發(fā)現(xiàn)，葉面噴施細(xì)胞分裂素可提高其結(jié)莢率和種子產(chǎn)量[33-35]。本研究中，10 和 20 mg·L-1的6-BA處理后，苜蓿的結(jié)莢率、千粒重及種子產(chǎn)量均高于對(duì)照，表明6-BA可提高紫花苜蓿結(jié)莢率和種子產(chǎn)量。但 30 mg·L-16-BA 處理下，雖然單序小花數(shù)最多，但單序莢果數(shù)較少，所以結(jié)莢率及種子產(chǎn)量?jī)H略高于對(duì)照，這可能是由于噴施的6-BA溶液濃度較高，影響了苜蓿的內(nèi)源激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致了苜?；ê颓v的脫落。

4 結(jié)論

20 mg·L-16-BA處理后，提高了苜蓿葉片的光合能力和葉片的抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性，減輕了葉片的膜脂過(guò)氧化程度，并提高了苜蓿的結(jié)莢率及單株種子產(chǎn)量，與對(duì)照相比，結(jié)莢率提高了14.08%，單株種子產(chǎn)量提高了11.48%。