外源脯氨酸對鹽脅迫下蘿卜幼苗生長、抗氧化酶活性及滲透調節(jié)物質積累的影響

王 瑋,吳傳萬,王 欣,趙建鋒*,汪國蓮,孫玉東

(1.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農業(yè)科學研究所,江蘇 淮安 223001; 2.淮陰師范學院 江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農業(yè)生物技術重點實驗室,江蘇 淮安 223300)

土壤鹽漬化(soil salinization)是指土壤中的易溶性鹽分在土壤表層積累的現(xiàn)象或過程,也稱鹽堿化。近幾十年來,隨著人類對土地的過度開墾,化肥、農藥的過量使用,耕地休耕制度執(zhí)行不到位,土壤鹽漬化現(xiàn)象越來越成為一個全球性的問題。鹽害已成為影響作物生長和作物產量的主要因素,可以導致作物平均單位面積產量降低50%以上[1-2]。目前,全球鹽堿土壤面積約為9.6億hm2,占灌溉農田的1/3,我國約有1億hm2,主要分布在西北、華北、東北和濱海地區(qū)[3]。在我國,隨著設施大棚面積的逐年增長、化肥的過量使用,設施農業(yè)的土壤次生鹽漬化現(xiàn)象也越來越突出,嚴重制約了農業(yè)生產。

在鹽脅迫條件下,大部分植物會表現(xiàn)出一系列的生理生化反應失調[4]。現(xiàn)有研究表明,鹽脅迫會抑制植物的光合作用，造成生理代謝失調，引起植物的氧化脅迫和離子毒害，抑制植物的生長發(fā)育,甚至導致死亡。同時,在鹽脅迫下,植物通過對礦質離子的選擇性吸收、提高細胞滲透調節(jié)能力、提高離子區(qū)域化水平和活性氧清除機制來提高植物本身對鹽脅迫的耐受性[5-8]。

蘿卜是我國重要的蔬菜作物,在全國各地均有栽培[9]。鹽害等逆境脅迫已成為我國蘿卜減產的主要原因之一,而在鹽脅迫下蘿卜生長發(fā)育及相關生理響應方面的研究不多。脯氨酸(Proline, Pro)因其分子量小、水溶性大、對細胞無毒副作用,是植株內最重要的有機滲透調節(jié)物質,幾乎所有的逆境如干旱、高溫、低溫、鹽漬、冰凍、大氣污染等都會造成植株內脯氨酸的積累[10-11]。在鹽脅迫下,植物通過主動積累脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、甜菜堿、多胺等有機滲透調節(jié)物質,發(fā)揮它們的滲透調節(jié)作用,以維持細胞膨壓,從而提高細胞的滲透調節(jié)能力[12]。已有研究證實,外源脯氨酸可以提高高溫脅迫和鹽脅迫下黃瓜[13]、甜瓜[14]等蔬菜作物的抗?jié)B透脅迫能力,但尚未見鹽脅迫下外源脯氨酸對蘿卜體內抗氧化系統(tǒng)及有機滲透調節(jié)物質的影響等相關報道。因此,本文以蘿卜為試驗材料,研究了外源脯氨酸對NaCl單鹽脅迫下蘿卜幼苗生長、抗氧化系統(tǒng)及滲透調節(jié)物質積累的影響，以期為明確外源脯氨酸提高鹽脅迫下蘿卜植株的耐鹽性機制提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

以四季蘿卜品種揚花蘿卜為試驗材料。先用自來水連續(xù)沖洗蘿卜種子1遍,再用蒸餾水清洗2次,然后播于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內,置于28 ℃的培養(yǎng)箱中催芽。待種子全部破白后,取發(fā)芽一致的種子播種于128孔穴盤中,育苗基質采用“優(yōu)佳”牌蔬菜育苗專用基質(由江蘇徐淮地區(qū)淮陰農業(yè)科學研究所研制生產)。當幼苗生長至2葉1心時,選擇整齊一致的植株定植于裝有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的水槽內進行預培養(yǎng),營養(yǎng)液pH值調節(jié)為6.5±0.2,電導率(EC)調節(jié)為(2.3±0.2)ms/cm。利用通氣泵進行間歇通氣,保持適宜的溶解氧濃度。在預培養(yǎng)5 d后,將蘿卜幼苗分為以下4組,設置處理如下:正常營養(yǎng)液培養(yǎng)(對照)，1/2 Hoagland營養(yǎng)液;脯氨酸處理，1/2 Hoagland營養(yǎng)液+0.3 mmol/L Pro; NaCl脅迫處理，1/2 Hoagland營養(yǎng)液+100 mmol/L NaCl; NaCl脅迫+Pro處理，1/2 Hoagland營養(yǎng)液+100 mmol/L NaCl+0.3 mmol/L Pro。每個處理30株苗,3次重復；為了保證營養(yǎng)液的穩(wěn)定,營養(yǎng)液每兩天更換1次。

1.2 測定方法

1.2.1 幼苗生長指標的測定 在處理7 d后,每處理分別取10株幼苗,用直尺分別測定其株高和主根長度；再將幼苗用自來水沖洗干凈,再用蒸餾水漂洗2次,吸干表面水分后,將幼苗從根莖連接處剪斷,分別稱取地上部及地下部鮮重；然后將樣品置于105 ℃的烘箱中殺青15 min,在75 ℃下烘干至恒重,再分別稱取地上部及地下部干重。

1.2.2 抗氧化酶活性的測定 分別于處理后第0、1、4、7、10天取幼苗生長點下第2片展開的真葉，進行抗氧化酶活性的測定。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)光還原法[15],以抑制NBT光化還原的50%酶量為1個酶活力單位(U)； POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法,按照李合生[16]的方法，測定470 nm處的OD值,以OD470每分鐘增加0.01為1個酶活力單位(U);過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用李合生[16]的方法,以OD240每分鐘減少0.1為1個酶活力單位(U)。以上酶活性的計量單位均為U/mg。

1.2.3 滲透調節(jié)物質含量的測定 分別于處理后第0、1、4、7、10天取幼苗生長點下第2片展開的真葉，進行滲透調節(jié)物質含量的測定?？扇苄钥偺呛康臏y定采用蒽酮比色法,可溶性蛋白含量的測定采用Bradford考馬斯亮藍G-250法,均按照李合生[16]的方法測定。脯氨酸(Pro)含量采用水合茚三酮法[17]測定。

1.3 數據分析

采用Excel 2010和DPS v14.10高級版對試驗數據進行處理和統(tǒng)計分析,用Duncan’s新復極差法進行平均數間的多重比較,使用SigmaPlot 12.0軟件進行制圖。

2 結果與分析

2.1 外源Pro對鹽脅迫下蘿卜幼苗生長指標的影響

由表1可知,蘿卜幼苗經100 mmol/L NaCl處理7 d后,其地上部鮮重、干重,地下部鮮重、干重,以及株高與主根長等指標均全面下降,且與對照相比差異達顯著性水平(P<0.05),表明在NaCl脅迫下蘿卜幼苗的生長受到了顯著抑制。與對照相比,經0.3 mmol/L的Pro處理后蘿卜各項生長指標(除根冠比外)均有所提高,但差異未達顯著性水平。在NaCl脅迫下施用0.3 mmol/L Pro后,蘿卜的主要生長指標(除地下部鮮重、干重和根冠比外)均比單純NaCl脅迫時有顯著提高,且對地上部鮮重和干重的提高幅度均大于對地下部鮮重和干重的提高幅度,表明Pro可以有效地提高蘿卜幼苗在鹽脅迫下的耐鹽性,且對地上部的促進效果要強于地下部。

表1 外源Pro對鹽脅迫下蘿卜幼苗生長的影響

注:同列數據后附不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)。Pro處理:0.3 mmol/L Pro; NaCl處理:100 mmol/L NaCl; NaCl+Pro處理:100 mmol/L NaCl+0.3 mmol/L Pro。

2.2 外源Pro對鹽脅迫下蘿卜幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖1可知：在鹽脅迫處理前,各處理間蘿卜幼苗的SOD、POD、CAT活性均無顯著差異；經Pro預處理蘿卜幼苗的SOD、POD、CAT活性始終略高于對照；在NaCl脅迫下SOD活性明顯上升,于脅迫后第7天達到峰值,比對照增加了32.13%,但在脅迫維持10 d后其活性比峰值時下降了15.80%,但依然略高于對照；在NaCl+Pro處理下SOD活性顯著上升,至第7天時活性達到峰值,與單純NaCl脅迫相比有顯著性差異(P<0.05),但此后SOD活性明顯下降。

POD活性的變化趨勢與SOD相似,在NaCl處理以及NaCl+Pro處理下POD活性均于第7天時達到峰值,且NaCl+Pro處理的POD活性與單純NaCl處理間存在顯著性差異(P<0.05),但此后POD活性均有所下降。

在NaCl脅迫下CAT活性的變化趨勢與SOD、POD略有不同。隨著脅迫時間的延長,CAT活性緩慢上升,但NaCl+Pro處理下的CAT活性與單純鹽脅迫相比有明顯上升,并在脅迫后10 d達到峰值,比單純NaCl脅迫下的CAT活性提高了42.50%。

圖1 外源脯氨酸對鹽脅迫下蘿卜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

2.3 外源Pro對鹽脅迫下蘿卜幼苗體內有機滲透調節(jié)物質積累的影響

由圖2可知,經Pro預處理的蘿卜植株葉片內游離Pro、可溶性糖的含量在整個處理期內均明顯高于對照,而可溶性蛋白的含量則與對照無顯著差異。100 mmol/L的NaCl脅迫顯著提高了蘿卜幼苗葉片內游離Pro、可溶性糖和可溶性蛋白的含量,至處理第10天時達到峰值,與對照相比,3個指標分別提高了31.25%、19.58%和45.49%。在NaCl脅迫下施加外源Pro后,蘿卜幼苗葉片內游離Pro、可溶性糖和可溶性蛋白的含量進一步增加,其中游離Pro的含量比對照增加了68.96%,比單純鹽脅迫增加了28.73%,而可溶性蛋白的含量與單純鹽脅迫相比無顯著差異。

3 討論

在鹽脅迫下,土壤中高濃度的鹽離子會降低土壤水勢,產生滲透脅迫,直接影響植物細胞的代謝和植物對營養(yǎng)物質的吸收,嚴重抑制植物的生長發(fā)育。在本實驗中，經100 mmol/L NaCl處理7 d,蘿卜幼苗的主要生長指標均顯著下降,而根冠比有所提高,說明100 mmol/L NaCl脅迫對蘿卜幼苗地上部的抑制作用要大于對地下部的抑制作用。這與陳麗芳等[18]在黃瓜上的研究結果相似,但并不能說明鹽脅迫可以提高蘿卜植株的根冠比。事實上,隨著鹽濃度的升高,大部分植物根系受損嚴重,導致根冠比明顯下降。王玉鳳[19]使用100 mmol/L NaCl處理玉米幼苗,其植株根冠比為0.50,當NaCl濃度提高到200 mmol/L時,根冠比下降為0.43。結合本試驗結果，我們認為根系是植物最重要的負責營養(yǎng)吸收的器官,在中、低鹽濃度下,植株為了抵抗逆境,幼苗根系生長受抑制程度小于地上部,而相對強大的根系有利于植物抵抗逆境脅迫;在高鹽濃度下,根系受到較強的滲透脅迫和離子脅迫的影響,其生長受到嚴重抑制,導致根冠比下降明顯。

圖2 外源脯氨酸對鹽脅迫下蘿卜幼苗葉片滲透調節(jié)物質含量的影響

植物在正常生長情況下,其體內活性氧(ROS)的產生和清除處于一個動態(tài)平衡中,不會對植株造成傷害。但在鹽脅迫條件下,這種平衡被打破,造成ROS的積累[20]。過量的ROS會啟動膜脂過氧化連鎖反應并作用于膜蛋白,使膜脂不飽和度和膜流動性降低、膜透性增加。為了保護細胞免受過量的ROS的傷害,植株發(fā)展了一套完整的防御系統(tǒng),即活性氧清除系統(tǒng)。SOD、POD、CAT等作為作物體內重要的保護酶系統(tǒng)此時被激活,它們作為自由基凈化劑能夠消除鹽脅迫下產生的活性氧和過氧化物自由基,維持植株內活性氧代謝的平衡,確保細胞膜結構的穩(wěn)定性,抵御和修復逆境對植株造成的傷害[21]。許多研究表明,植株在鹽脅迫下,其抗氧化酶的活性會相應升高,耐鹽品種相比于鹽敏感性品種其活性更高[22-23]。Mittova等[24]發(fā)現(xiàn),與栽培番茄品種相比,野生型番茄品種的SOD、POD活性升高能更好地保護植株免受氧化脅迫損害。植物內抗氧化酶活性的高低往往決定著植物抗逆能力的強弱[25]。

本研究結果表明：使用100 mmol/L NaCl處理,明顯促進了蘿卜幼苗葉片內SOD、POD、CAT的活性；在鹽脅迫下施加外源Pro則進一步增強了以上3種抗氧化酶的活性。說明在鹽脅迫下,植物通過增強一系列抗氧化酶的活性來抵抗逆境。但是當逆境脅迫超過一定的時間后,逆境對植株所造成的破壞會超出植物的自我調節(jié)能力,此時抗氧化酶的活性就會明顯下降[26]。本研究中SOD、POD的活性變化即是如此,說明經100 mmol/L NaCl處理10 d,逆境已經對蘿卜細胞造成了一定的傷害,現(xiàn)有的抗氧化酶系統(tǒng)已經不足以抵抗過量的ROS所形成的氧化脅迫,隨著鹽脅迫的持續(xù),必然導致膜損傷,進而影響細胞代謝作用,引起一系列的代謝失調[27-29]。

在鹽脅迫下,植物吸水困難,造成滲透脅迫。這時植物會大量合成脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、甜菜堿等滲透調節(jié)物質,以協(xié)調細胞與外界的滲透壓平衡,保護細胞膜與蛋白質活性,以維持細胞的正常功能。其中脯氨酸是植株內最重要、也是目前研究最廣泛[30-31]的一類滲透調節(jié)物質。Huang Y等[32]研究發(fā)現(xiàn)施加適宜濃度的脯氨酸可顯著緩解鹽脅迫下作物幼苗氣孔導度的下降,提高水分和CO2的利用率,還可以有效清除作物體內的ROS,減輕鹽脅迫對葉綠素的破壞,維持葉綠素的功能。植株內可溶性碳水化合物對鹽脅迫、干旱脅迫的響應機制也已被廣泛報道[33]。Ashraf M等[34]在測定5種耐鹽性不同的向日葵的總可溶性糖含量后發(fā)現(xiàn),耐鹽品種與鹽敏感性品種相比,其可溶性糖的積累量顯著增高。Lopez等[35]研究發(fā)現(xiàn)在蘿卜中存在著22 kDa的蛋白專門響應鹽脅迫。在鹽脅迫下植物積累的這些可溶性蛋白可能是脅迫誘導而合成的,也可能是在非脅迫下以低濃度存在,而在脅迫下短時大量積累的,主要在滲透調節(jié)中發(fā)揮作用。本研究結果表明,100 mmol/L的NaCl脅迫明顯促進了蘿卜幼苗葉片內的游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的積累,有利于增強植株對鹽脅迫的抗性,而鹽脅迫下施加外源脯氨酸則進一步促進了游離脯氨酸的大量合成,促進了可溶性糖和可溶性蛋白的積累,維持了細胞滲透壓平衡,提高了植株的滲透調節(jié)能力,增強了植株對鹽脅迫的抗性?？梢?在鹽脅迫等逆境條件下,脯氨酸的大量積累對降低植物的滲透脅迫起到積極作用,有助于維持細胞的正常代謝,但也可以認為其是逆境脅迫的產物,是植物受到逆境傷害的征兆[36]。

4 結論

綜上所述,100 mmol/L的NaCl脅迫抑制了蘿卜幼苗的生長,提高了SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性,促進了有機滲透調節(jié)物質的積累。在鹽脅迫下施加外源脯氨酸則緩解了鹽脅迫對蘿卜幼苗生長的抑制作用,進一步提高了抗氧化酶系統(tǒng)的活性和有機滲透調節(jié)物質的含量,保護了細胞膜結構的穩(wěn)定性,增強了植株對脅迫的適應能力。