眼點(diǎn)擬微綠球藻養(yǎng)殖過程中致死細(xì)菌的分離鑒定與治理

趙鄢鵬,蔡忠貞,王 冰,耿金峰,白雪梅

(新奧集團(tuán) 新繹健康科技有限公司,河北 廊坊 065001)

藻類是海洋系統(tǒng)中最初級的、最重要的生產(chǎn)者。其種類繁多,它合成的物質(zhì)量約占全部光合作用合成生物量的1/3。藻類是具有極大應(yīng)用價值的生物資源,富含對人體有益的、具有重要生理作用和保健功能的長鏈多不飽和脂肪酸,可用于天然食品、生物肥料、生物餌料等方面,具有重要的社會價值和經(jīng)濟(jì)價值[1-3]。

目前國內(nèi)外很多高校和科研機(jī)構(gòu)都在對微藻進(jìn)行著深入的、系統(tǒng)的研究[4]。在養(yǎng)殖條件穩(wěn)定的情況下,微藻的產(chǎn)量較高,例如： Zhang等在日本的北方地區(qū),夏季利用1.5 cm板式反應(yīng)器培養(yǎng)集胞藻,在試驗控溫的情況下單位面積產(chǎn)量可達(dá)39.0 g/(m2·d)[5];據(jù)Moheimani等報道，顆石藻養(yǎng)殖的產(chǎn)量水平達(dá)16.0～33.5 g/(m2·d)[6]。但微藻企業(yè)在實(shí)際戶外養(yǎng)殖中的產(chǎn)量均不高,一般在5～10 g/(m2·d)。究其原因，除了受自然天氣、環(huán)境溫度的影響外,還有一個非常重要的原因是敵害生物污染問題。微藻養(yǎng)殖過程如果受到嚴(yán)重的敵害生物污染,那么可能會出現(xiàn)養(yǎng)殖顆粒無收的嚴(yán)重后果[7]。因此,在微藻養(yǎng)殖過程中敵害生物污染嚴(yán)重制約著微藻產(chǎn)量的提升,以及規(guī)?；倪M(jìn)程。國內(nèi)外的科學(xué)家對污染的關(guān)注度也是越來越高,微藻養(yǎng)殖過程的污染按照物種不同可分為原生動物污染和細(xì)菌污染,其中對原生動物污染目前研究成果顯著,例如叢立晶等利用酸化法、堿化法等對藻液中的纖毛蟲、游捕蟲進(jìn)行治理[8];吳松使用表面活性劑、漂白粉對原生動物進(jìn)行滅殺[9];規(guī)模化養(yǎng)殖上常用的方法還有碳酸銨鹽法等[7,10]。微藻敵害生物污染的另一類是細(xì)菌污染,其細(xì)菌種類繁多,而細(xì)菌和微藻是一個共生體[11-14],有些細(xì)菌對微藻生長有促進(jìn)作用,而有些細(xì)菌對微藻生長有抑制作用[15-17],甚至有些細(xì)菌具有溶藻的特性[18-20],可以導(dǎo)致藻細(xì)胞較快死亡,嚴(yán)重時將導(dǎo)致養(yǎng)殖失敗。例如朱曉漫等篩選到一種可以溶解銅綠微囊藻的細(xì)菌,經(jīng)分子鑒定為蠟狀芽孢桿菌,后續(xù)可以將其開發(fā)成生物控藻菌劑[19];郗建云等對張俊篩選到的海桿菌屬細(xì)菌的溶藻特性進(jìn)行了研究,該細(xì)菌對錐狀斯氏藻有顯著的溶藻作用,但對蛋白核小球藻與四尾柵藻無溶藻作用[20]。針對目前產(chǎn)業(yè)化藻株之一的眼點(diǎn)擬微綠球藻,其細(xì)菌污染治理方面的報道很少,尤其是在致死細(xì)菌的分離鑒定方面未見報道。但眼點(diǎn)擬微綠球藻的細(xì)菌污染問題同樣是制約其穩(wěn)定養(yǎng)殖、產(chǎn)量提高、規(guī)?；M(jìn)程的一個關(guān)鍵因素。因此,我們以本公司戶外養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的由于細(xì)菌污染而快速死亡的眼點(diǎn)擬微綠球藻藻液為研究對象,通過平板劃線法和高通量篩選技術(shù)分離了導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡的細(xì)菌，通過16S rDNA全長序列擴(kuò)增及測序等技術(shù)鑒定了致死細(xì)菌的屬、種,并研究了該致死細(xì)菌的有效殺滅方法,旨在為眼點(diǎn)擬微綠球藻的戶外穩(wěn)定養(yǎng)殖提供有效的細(xì)菌污染治理方法,促進(jìn)微藻規(guī)?；B(yǎng)殖進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

硫酸慶大霉素(以下簡稱為慶大霉素),購自煙臺只楚藥業(yè)有限公司，為1 kg獨(dú)立包裝,規(guī)格為10億/桶。將慶大霉素配制成1 g/L的母液后,根據(jù)需要進(jìn)行稀釋(母液經(jīng)0.22 μm濾膜除菌,稀釋操作全過程在無菌條件下進(jìn)行)。本研究所用的其它試劑均為常規(guī)分析純試劑。EXTaq酶、dNTP、MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction kit購自TaKaRa公司;序列由Sangon公司測定;引物由Sangon公司合成。

1.2 主要儀器

分光光度計,日本島津UV-2550型。高通量篩選平臺,上海定制HYG-CTCYQ。PCR儀, BIO-RAD T100Thermal cycler, USA。

1.3 藻種與培養(yǎng)

眼點(diǎn)擬微綠球藻(Nannochloropsisoculata),由ENN生物質(zhì)能源技術(shù)中心藻種質(zhì)庫提供。所有實(shí)驗培養(yǎng)基均采用f/2海水培養(yǎng)基[8],鹽度為(3.3±0.1)%。實(shí)驗采用批次培養(yǎng)的方式進(jìn)行。

細(xì)菌污染的藻液,簡稱污染藻液(下同):來自眼點(diǎn)擬微綠球藻的戶外培養(yǎng)過程,細(xì)菌數(shù)量在106個/mL數(shù)量級以上。

1.4 實(shí)驗方法

1.4.1 接種密度 利用藻液進(jìn)行的各實(shí)驗組的接種細(xì)胞密度在0.8～0.9 g/L之間,主要以各實(shí)驗組相同體積下具有相同的生物質(zhì)量為原則。

1.4.2 實(shí)驗用反應(yīng)器規(guī)格 為內(nèi)徑5 cm、高度80 cm的玻璃柱式(管式)反應(yīng)器,一側(cè)密封，另一側(cè)開口。

1.4.3 致死細(xì)菌的分離和培養(yǎng)

1.4.3.1 細(xì)菌單菌落的分離和二次培養(yǎng) 將在戶外養(yǎng)殖過程中存在細(xì)菌污染的藻細(xì)胞液稀釋10倍,利用平板涂布法進(jìn)行細(xì)菌單菌落的分離;對所得到的單菌落進(jìn)行二次培養(yǎng),最終獲得多株單菌落的細(xì)菌細(xì)胞。

1.4.3.2 單菌落細(xì)菌的液體培養(yǎng) 利用高通量篩選平臺,將單菌落細(xì)胞加入到5 mL的24孔板中(高通量篩選平臺專用),在31 ℃下以140 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24 h。

1.4.3.3 致死細(xì)菌的確定 利用高通量篩選平臺,將活化后的細(xì)菌液5 mL加入到裝有30 mL藻液的100 mL三角瓶中,在25 ℃下以140 r/min培養(yǎng),加30 μE的人工光源,根據(jù)藻細(xì)胞的死亡情況最終確定致死細(xì)菌編號。

1.4.4 致死細(xì)菌的鑒定

1.4.4.1 細(xì)菌基因組DNA的提取 使用MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction kit提取基因組DNA。

1.4.4.2 細(xì)菌16S rDNA全長序列擴(kuò)增及測序 參照Bosshard的方法。16S rDNA通用引物序列如下:8f， 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。25 μL PCR反應(yīng)體系包括2.5 μL的10×PCR反應(yīng)緩沖液、1 μL dNTP (2.5 mmol each)、1 U Taq酶、10 μmol的上、下游引物各0.5 μL、DNA模板約50 ng。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 80 s,共30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物送交Sangon公司測序。

1.4.4.3 致死細(xì)菌屬、種的確定 根據(jù)測序結(jié)果,通過NCBI比對,確定致死細(xì)菌的屬、種。

1.4.5 致死細(xì)菌治理方法的研究 將獲得的致死細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃、120 r/min轉(zhuǎn)速、f/2+LB培養(yǎng)基。將經(jīng)活化15 h的細(xì)菌液5 mL加入到100 mL的三角瓶中,再加入30 mL的f/2培養(yǎng)基，即為獲得的細(xì)菌培養(yǎng)液。

向次氯酸鈉組的細(xì)菌培養(yǎng)液中分別添加0.015、0.030 g/L的細(xì)菌治理試劑次氯酸鈉溶液；向慶大霉素組的細(xì)菌培養(yǎng)液中分別添加0.050、0.200 g/L的細(xì)菌治理試劑慶大霉素溶液；CK 1組(受到污染的藻液)不添加細(xì)菌治理試劑。對各組的細(xì)菌培養(yǎng)液在31 ℃條件下以140 r/min的轉(zhuǎn)速在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),8 h和24 h后各測定1次OD750。同時根據(jù)需要不定時地取樣涂平板,觀測細(xì)菌情況。每組設(shè)3個平行樣。

1.4.6 細(xì)菌治理效果的驗證 將受到細(xì)菌污染的藻液裝入玻璃柱式反應(yīng)器中,每個反應(yīng)器的裝液量為800 mL；向?qū)嶒?組、實(shí)驗2組和實(shí)驗3組加入細(xì)菌治理試劑次氯酸鈉溶液,使有效氯的濃度分別達(dá)到0.015、0.020、0.030 g/L; CK 1和CK 2(無污染的藻液)組均不添加細(xì)菌治理試劑。在操作時，先將次氯酸鈉母液稀釋1000倍，然后將其緩慢加入藻液中,混合10 min后,停止通氣,避光放置；18 h后在200 μE光強(qiáng)的人工光下通入空氣與二氧化碳(5%含量)的混合氣，連續(xù)培養(yǎng)7 d,每天監(jiān)控藻細(xì)胞的濃度，并在光學(xué)顯微鏡下檢查。每組設(shè)3個平行樣。

1.5 生物量的測定[21]

取體積量為V的藻液,首先利用離心機(jī)以3500 r/min進(jìn)行離心，分離藻細(xì)胞和培養(yǎng)液,藻液中的細(xì)菌由于自身質(zhì)量輕、形態(tài)小,將在培養(yǎng)液層存在,該培養(yǎng)液層被去除;再加入體積量為5V的一次水進(jìn)行藻泥層的溶解,待混勻后進(jìn)行抽濾,此時將藻細(xì)胞截留在濾膜(恒定質(zhì)量,m0)上,并用等體積量的蒸餾水懸浮藻細(xì)胞3次,最后將濾膜于105 ℃的烘箱過夜至恒定質(zhì)量,冷卻后稱重，得質(zhì)量m1。藻細(xì)胞質(zhì)量濃度的計算公式為：細(xì)胞質(zhì)量濃度(g/L)=(m1-m0)/V。

2 結(jié)果與分析

2.1 致死細(xì)菌的分離與鑒定

受到細(xì)菌污染的藻液通過稀釋、經(jīng)過平板劃線法培養(yǎng)，得到24株單細(xì)胞菌落,并對每株單細(xì)菌的菌落進(jìn)行二次分離,最后進(jìn)行細(xì)菌的純培養(yǎng),24株細(xì)菌的形態(tài)如圖1所示。

圖1 24株分離細(xì)菌的形態(tài)

將細(xì)菌菌液加入藻液中,觀察其致死效果。對24株單菌落細(xì)菌進(jìn)行傳代培養(yǎng),將活化后的細(xì)菌液體5 mL加到30 mL藻液中,培養(yǎng)24 h后,觀察藻細(xì)胞生長情況。實(shí)驗結(jié)果如圖2所示,47#菌液明顯能夠?qū)е略寮?xì)胞死亡,其具有溶藻作用。因此,對47#細(xì)菌進(jìn)行菌種的分子鑒定。

提取47#致死細(xì)菌的基因組DNA,通過細(xì)菌16S rDNA通用引物擴(kuò)增并測序得到47#細(xì)菌的16S rDNA序列,在NCBI上進(jìn)行Blast比對，結(jié)果如圖3所示,其與噬纖維菌目(Cytophagales)嗜冷菌(Algoriphagusnamhaensis, NR_109104.1)的覆蓋率達(dá)到99%,一致性達(dá)到97%。47#細(xì)菌經(jīng)染色鑒定為革蘭氏陰性菌,存在于微藻海水培養(yǎng)液中,菌落顏色為紅色,這些與噬纖維菌目的生態(tài)特點(diǎn)完全符合。該細(xì)菌的菌落形態(tài)如圖4所示。

2.2 致死細(xì)菌的治理方法

2.2.1 治理方法對比 鑒定出的致死細(xì)菌屬于噬細(xì)胞菌屬。利用我公司在治理細(xì)菌污染方面較有效的兩種方法有效氯法和抗生素法對致死細(xì)菌進(jìn)行治理研究。在對噬細(xì)胞菌屬滅殺過程中菌體濃度的檢測結(jié)果如圖5所示,由圖5可見：噬細(xì)胞菌在純海水培養(yǎng)基中生長較慢;在24 h時添加LB培養(yǎng)基后,除0.030 g/L有效氯實(shí)驗組的OD580值一直較低外,其它實(shí)驗組的OD580值均先后出現(xiàn)增長現(xiàn)象,說明0.030 g/L有效氯對于噬細(xì)胞菌屬Algoriphagus的滅殺效果較好,其它方法的滅殺效果均較差。

圖2 22株分離細(xì)菌對藻細(xì)胞生長的影響

圖3 47#細(xì)菌與嗜冷菌16S rDNA的部分序列比較

2.2.2 對嗜冷菌Algoriphagus的32 h和48 h殺滅率 從圖6可以看出：在32 h時不同濃度有效氯對嗜冷菌Algoriphagus的殺滅效果均較好,殺滅率均在80%以上；在48 h時,0.015 g/L有效氯的殺滅率有所下降,而0.030 g/L有效氯的殺滅率一直較高;0.050 g/L慶大霉素的殺滅效果較差,32 h時的殺滅率僅為20%；0.200 g/L慶大霉素在32 h時的殺滅率較高,但48 h后殺滅率下降。因此,0.030 g/L有效氯對嗜冷菌Algoriphagus的滅殺效果最好。

圖4 可導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡的致死細(xì)菌嗜冷菌

圖5 不同治理方法對噬細(xì)胞菌屬

圖6 不同治理方法對Algoriphagus的殺滅效果

2.2.3 嗜冷菌Algoriphagus在32 h時的三角瓶照片和在48 h時的涂板結(jié)果 從圖7上部可以看出：在實(shí)驗32 h時,有效氯實(shí)驗組三角瓶中的菌液都較清澈,而慶大霉素實(shí)驗組的較渾濁,尤其是0.050 g/L慶大霉素組的渾濁度更高,說明32 h時有效氯對嗜冷菌Algoriphagus的滅殺效果比慶大霉素要好。從圖7下部的涂板結(jié)果可見：在48 h時只有0.030 g/L有效氯實(shí)驗組的菌落較少,而其它實(shí)驗組的菌落均較多。上述結(jié)果與細(xì)菌液的OD580值結(jié)果相吻合。

2.3 對嗜冷菌Algoriphagus治理效果的驗證

2.3.1 治理前后眼點(diǎn)擬微綠球藻細(xì)胞的生長情況 由圖8可知,受到噬細(xì)胞菌屬污染的CK1組藻液經(jīng)過幾日的繼續(xù)培養(yǎng),其藻細(xì)胞逐漸死亡;通過光學(xué)顯微鏡觀察,在藻液中明顯有大量短桿狀的細(xì)菌。而在有效氯治理實(shí)驗組中藻細(xì)胞生長得到明顯的恢復(fù),尤其是在開始階段,細(xì)菌受到治理后藻細(xì)胞生長恢復(fù)到正常。但由于0.015 g/L有效氯(實(shí)驗1組)不能完全殺滅嗜冷菌,因此在后期藻細(xì)胞的生長速度受到了明顯的抑制,但在7 d的養(yǎng)殖周期內(nèi),由于前期細(xì)菌被大量殺滅,藻細(xì)胞生長狀態(tài)逐漸變好,后期藻細(xì)胞生長仍較好。實(shí)驗2組有效氯的添加量為0.020 g/L,此劑量對藻細(xì)胞的影響不顯著,而且對嗜冷菌具有明顯的殺滅作用,因此在該組中藻細(xì)胞的生長狀態(tài)與未污染的藻細(xì)胞相當(dāng)。而在0.030 g/L有效氯實(shí)驗組(實(shí)驗3組)中,有效氯的添加量過大,對藻細(xì)胞造成了明顯的損傷,導(dǎo)致第1天藻細(xì)胞濃度出現(xiàn)負(fù)增長；但隨著養(yǎng)殖時間的延長,嗜冷菌被大量殺滅，因此藻細(xì)胞的生長狀態(tài)得到逐漸恢復(fù),但其仍不如實(shí)驗2組的。

2.3.2 方差分析結(jié)果 污染藻液治理實(shí)驗進(jìn)行了3輪重復(fù)(實(shí)驗條件保持不變),均以7 d為培養(yǎng)周期,并以該周期內(nèi)各實(shí)驗組藻細(xì)胞生物量增量為考查對象。3輪實(shí)驗數(shù)據(jù)及其方差分析結(jié)果見表1、表2、表3。

對3輪養(yǎng)殖實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,F0.05(4,9)=3.48,因此F=593.38>3.48,P<0.05,差異極顯著。說明各實(shí)驗組因素均對實(shí)驗結(jié)果有顯著的影響。

3 討論

微藻戶外規(guī)模化養(yǎng)殖過程受污染問題導(dǎo)致戶外養(yǎng)殖產(chǎn)量低,甚至無法養(yǎng)殖。在微藻養(yǎng)殖過程中主要的生物污染源有原生動物、細(xì)菌、真菌和其它藻類。由于細(xì)菌種類多,繁殖快,治理難,因此對微藻的規(guī)?；B(yǎng)殖影響最大。微藻污染菌類不僅與養(yǎng)殖的藻類有關(guān),與養(yǎng)殖時間、環(huán)境也關(guān)系密切。由于不同微藻養(yǎng)殖過程中污染的細(xì)菌完全不同,針對微藻細(xì)菌污染的治理方法也完全不同,因此檢測、鑒定微藻養(yǎng)殖過程中污染細(xì)菌的屬、種是建立有效的污染防治方法的基礎(chǔ)。

圖7 在實(shí)驗過程中嗜冷菌被殺滅情況

圖8 治理前后受污染藻液細(xì)胞的生長情況

處理第1輪第2輪第3輪CK1-0.84-0.78-0.82CK22.542.502.45實(shí)驗11.791.871.83實(shí)驗22.442.602.20實(shí)驗31.041.121.09

表2 單因素方差分析結(jié)果1

自然界中的細(xì)菌種類繁多,只要少部分能夠通過人工培養(yǎng)繁殖并獲得單克隆菌株。如何培養(yǎng)分離獲得微藻養(yǎng)殖過程中的致病菌是一個挑戰(zhàn)。本實(shí)驗根據(jù)微藻污染細(xì)菌的生長特性,嘗試用不同的培養(yǎng)基配方和人工培養(yǎng)條件,將微藻自養(yǎng)培養(yǎng)基與LB細(xì)菌異養(yǎng)培養(yǎng)基相結(jié)合,獲得了較好的菌株培養(yǎng)與菌落分離效果。通過形態(tài)學(xué)與分子鑒定分析,獲得了24株不同的細(xì)菌菌株,較好地解決了微藻污染菌培養(yǎng)難、分離難的問題。

表3 單因素方差分析結(jié)果2

本實(shí)驗經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)、分離菌落與DNA分子鑒定,對微藻污染菌群的細(xì)菌組成進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)直接導(dǎo)致微藻死亡裂解的細(xì)菌為47#菌,該菌在正常養(yǎng)殖階段豐度較低,在微藻受污染暴發(fā)時,快速生長繁殖。47#菌為嗜冷菌Algoriphagus,能夠?qū)е挛⒃逍跄呀?是導(dǎo)致微藻養(yǎng)殖失敗的主要原因,因此,在微藻養(yǎng)殖過程中如何有效控制47#菌的生長繁殖是微藻污染防治的關(guān)鍵。

目前,在微藻開放池養(yǎng)殖過程中進(jìn)行細(xì)菌防治的方法很多,主要有用次氯酸鈉或漂白粉全池潑灑,或用抗生素全池潑灑等方法。本實(shí)驗結(jié)果表明：雖然0.030 g/L有效氯對47#細(xì)菌的治理率高達(dá)90%,但該濃度有效氯對藻細(xì)胞也具有非常大的損傷；0.020 g/L有效氯對該細(xì)菌的治理效果比較理想,既能夠有效地防止微藻養(yǎng)殖過程中的細(xì)菌污染,同時對藻細(xì)胞的損傷也低。本實(shí)驗結(jié)果為戶外微藻養(yǎng)殖過程中的細(xì)菌污染治理提供了參考,也為細(xì)菌污染的深入研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。