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    大麻葉中總黃酮提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性測定

    2019-04-04 06:51:16劉毅冷鵑劉亮亮肖愛平
    中國麻業(yè)科學(xué) 2019年1期
    關(guān)鍵詞:葉總大麻黃酮

    劉毅,冷鵑,劉亮亮,肖愛平

    (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所,湖南長沙410205)

    大麻(CannabissativaL.),別名漢麻、線麻、火麻等,是大麻科大麻屬一年生草本植物,包括纖維用大麻、藥用大麻、野生大麻等3類[1]。大麻用途很多,可以提供纖維、纖維素、種子和種子油、大麻醇類物質(zhì),以及生物質(zhì)材料,此外還可作為研究特殊代謝途徑的模式植物,具有很大的開發(fā)價值[2]。大麻還具有藥用價值,根莖葉均可入藥,大麻花主治記憶力衰退;大麻籽主治便秘、消渴、血痢不止、發(fā)落不生等;大麻莖或莖皮主治破血、跌打損傷等[3]。我國是世界上最主要的大麻生產(chǎn)國,南起云南,北達(dá)黑龍江都有大麻種植,大麻在我國主要用作紡織原料[4]。大麻的葉、花、莖中有62種化合物,包括黃酮及其苷類化合物、生物堿類化合物、香豆素類化合物、萜類及甾醇類化合物、脂肪酸類化合物、菲類化合物及其他化合物[5],其中黃酮為極具研究價值的活性物質(zhì)。

    黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基[6]、抗突變、抗衰老、抗菌[7]、抗腫瘤[8]等生物活性,有強(qiáng)心、擴(kuò)張冠狀動脈、降血壓、降血脂、祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘以及減少糖醇堆積、利于白內(nèi)障防治等藥用功效[9]。在抗氧化作用上,黃酮表現(xiàn)為對單線態(tài)氧及含氧自由基的清除能力,其中,單線態(tài)氧以及生物系統(tǒng)中產(chǎn)生的自由基如超氧化物自由基和羥基自由基均可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),損傷細(xì)胞[10]。目前黃酮類化合物的提取方法包括水提法、有機(jī)溶劑提取法、微波提取法、超聲波提取法、酶解法、大孔樹脂吸附法和超濾法等[11]。在黃秋葵[12]、金雀花[13]、苦參[14]、枇杷[15]、半枝蓮[16]、薄荷[17]、水芹[18]等植物中,對黃酮提取工藝及抗氧化性研究均有報道。大麻中黃酮提取純化工藝的研究已有報道[19],而對其抗氧化能力的研究還未見報道。黃酮類化合物多數(shù)以甙的形式存在,少數(shù)以游離形式存在,是一種很強(qiáng)的活性氧自由基清除劑,已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[20]。不同植物中黃酮提取的最佳條件及抗氧化能力存在差異:在沙棘中,確定最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60&、提取時間 40 min、料液比1∶50(g/mL);在黃秋葵中,最佳提取工藝為料液比1∶25(g/mL)、提取時間2 min、提取溫度75℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50&,沙棘果渣黃酮和黃秋葵黃酮提取液對羥自由基和超氧陰離子自由基均有一定的清除作用,表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性[21]。

    本試驗(yàn)以大麻葉片為試驗(yàn)材料,探究回流法提取大麻葉片總黃酮的工藝條件,即以總黃酮浸提量為評價指標(biāo),運(yùn)用單因素試驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比、提取溫度對黃酮提取效率的影響,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化總黃酮提取工藝;通過FRAP法、ABTS法、DPPH自由基清除能力等測定黃酮的總抗氧化能力,評價大麻葉總黃酮的體外抗氧化活性,旨在為大麻葉總黃酮的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大麻葉:“大麻2號”頂部向下8~12片成熟葉,隨機(jī)采集于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所麻類種質(zhì)資源圃。采集葉片后,于烘箱中45℃干燥充分,粉碎得到大麻葉粉末,供后續(xù)試驗(yàn)用。

    蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司,分析純)、乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純)、甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純)、乙酸鉀(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純)、六水合三氯化鋁(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純)。

    FRAP試劑盒(南京建成有限公司)、DPPH試劑盒(南京建成有限公司)、ABTS試劑盒(南京建成有限公司)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    PB602-L電子天平(梅特勒-托利多國際有限公司)、KY15-19粉碎機(jī)(天津美斯特有限公司)、UV-2700紫外可見分光光度計(島津企業(yè)管理有限公司)、EV351旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京萊伯泰儀器股份有限公司)、BPG-9140A風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、KQ-5200DV超聲波清洗器(昆山市儀器超聲有限公司)、WEB-6多孔水浴鍋(DAIHAN Scientific Co,Ltd)。

    1.3 方法

    1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品20 mg,加甲醇溶解并定容到100 mL,得到0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL于10 mL容量瓶中,加甲醇定容,搖勻,得到0.005、0.010、0.020、0.040、0.060、0.080mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液,各取1mL到試管中,加入2 mL 0.10 mol/L三氯化鋁溶液,搖勻,靜置6 min,再加入3 mL 1 mol/L乙酸鉀溶液,搖勻后靜置6 min,再用甲醇(甲醇∶水(V∶V)=70∶30)溶液定容到10 mL,靜置15 min后,于420 nm波長下測定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.2 總黃酮含量測定

    準(zhǔn)確稱取大麻葉粉末3批,每批2 g,分別加入乙醇溶液后在一定溫度下回流提取,將提取液過濾,然后用乙醇溶液定容到100 mL。取提取液1 mL至10 mL比色管中,各加入2 mL 0.10 mol/L三氯化鋁溶液搖勻,靜置6 min,再加入3 mL 1 mol/L乙酸鉀溶液,搖勻,靜置6 min,再加入甲醇溶液(甲醇∶水(V∶V)=70∶30)定容至刻度,放置15 min。樣品空白不加顯色劑,分別在420 nm波長處測定其吸光度,保證吸光值在線性范圍內(nèi)。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算濃度數(shù)據(jù)C(mg/mL)(以蘆丁為參比),3次結(jié)果取平均值。按公式(1)計算總黃酮浸提量。

    式中:X—測出的濃度,mg/mL;

    n—稀釋倍數(shù),量綱為1;

    V—測定時取樣體積,mL;

    W—樣品質(zhì)量,g。

    1.3.3 單因素試驗(yàn)

    分別以提取時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h),乙醇體積分?jǐn)?shù)(50&、60&、70&、80&、90&、100&),料液比(g/mL)(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30),提取溫度(50、60、70、80、90℃),提取次數(shù)(1、2、3、4次)為單因素,考察其對總黃酮浸提量的影響。

    1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計[22]。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度為影響因素,以總黃酮浸提量為評價指標(biāo),提取2次,設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn),中心試驗(yàn)重復(fù)4次,共29個試驗(yàn)點(diǎn)[23]。試驗(yàn)因素水平如表1所示。

    表1 響應(yīng)面分析因素與水平編碼值Table 1 Factors and levels of response surface analysis

    1.3.5 FRAP法測定總抗氧化能力

    參照試劑盒的FRAP法測定總黃酮的總抗氧化能力??偪寡趸芰τ肍eSO4標(biāo)準(zhǔn)液的濃度表示。FRAP工作液按照檢測緩沖液、基質(zhì)液與底物液體體積比為10∶1∶1配置,充分混合避光37℃孵育,現(xiàn)配現(xiàn)用,1~2 h內(nèi)用完。標(biāo)準(zhǔn)品 FeSO4·7H2O溶液設(shè)置 0.10、0.20、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L 6個濃度梯度,各取5μL與180μL FRAP工作液反應(yīng)后測定A593,以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品檢測取5μL,設(shè)置3次重復(fù),測定吸光度后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其總抗氧化能力(以FeSO4.7H2O為參比)。

    1.3.6 ABTS快速法測定總抗氧化能力

    參考T-AOC試劑盒(ABTS快速法)測定總黃酮總抗氧化能力,用相對Trolox總抗氧化能力表示。Trolox標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置0.1、0.2、0.3、0.4、0.8、1.0 mmol/L 6個濃度梯度,與過氧化物酶工作液、ABTS工作液反應(yīng)后在414 nm波長下測吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測定組為稀釋的黃酮提取液與過氧化酶工作液、ABTS工作液反應(yīng),反應(yīng)相同時間后測吸光值A(chǔ)414,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮相對于Trolox的總抗氧化能力(以Troxlox為參比)。

    1.3.7 DPPH自由基清除能力測定

    取1mg DPPH溶解于20mL的甲醇,超聲5 min,配制成DPPH溶液。取DPPH溶液2mL加入5個試管中,依次加入樣品液20、40、60、80、120μL,加入相應(yīng)體積的無水乙醇定容到3 mL,混合反應(yīng)5 min后,在519 nm波長處測得吸光值A(chǔ)1;空白對照組用2 mL無水乙醇代替DPPH溶液[24-25],反應(yīng)相同時間后,測定519 nm波長下吸光值A(chǔ)0。此外,抗壞血酸(VC)作陽性對照。DPPH自由基清除率按式 (2)計算。

    假設(shè)樣品的最大抑制率是100&,此時A1=A2;最小抑制率是0,此時A2-A1=A0,

    式中:A0—空白吸光度;

    A1—樣品吸光度;

    A2—最小吸光度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

    以吸光度(A)為縱坐標(biāo),蘆丁質(zhì)量濃度(C,mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=31.35x-0.0114,R2=0.994,相關(guān)性良好,線性范圍 0.05~0.08 mg/mL。

    2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 提取時間對大麻葉總黃酮浸提量的影響

    以1∶15(g/mL)料液比加入無水乙醇,在70℃的水浴鍋中回流提取1次,測定不同提取時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)對總黃酮浸提量的影響。由圖2可知,在提取時間1~2 h內(nèi),隨著提取時間的增加,總黃酮浸提量也隨之增加,而在2 h后出現(xiàn)降低趨勢,2.5 h后緩慢增加。這是由于提取時間會影響大麻葉細(xì)胞壁的破壞程度,隨著提取時間增長,細(xì)胞壁破壞更加充分,更多黃酮得以釋放,達(dá)到閾值后,提取時間過長,黃酮可能被破壞[16]。因此,提取時間優(yōu)選為2.0 h。

    圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

    圖2 提取時間對大麻葉總黃酮浸提量的影響Fig.2 The effect of extraction time on the yield of flavonoids from hemp leaves

    2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對大麻葉總黃酮浸提量的影響

    以1∶15(g/mL)料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇(50&、60&、70&、80&、90&、100&),在70℃水浴鍋中提取2.0 h,提取1次,測定乙醇體積分?jǐn)?shù)對大麻葉總黃酮浸提量的影響。由圖3可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)為80&時,總黃酮浸提量最大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50&~80&時,總黃酮浸提量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加,而乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80&后則有所降低。乙醇可影響葉片細(xì)胞穿透能力,從而改變黃酮提取效率,此外,乙醇體積分?jǐn)?shù)過高,可能導(dǎo)致其他醇溶性物質(zhì)被提出,而總黃酮溶出較少[26]。

    2.2.3 料液比對大麻葉總黃酮浸提量的影響

    以不同料液比 (g/mL)(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)加入 80&乙醇,在 70℃水浴鍋中提取2.0 h,提取1次,測定料液比對大麻葉總黃酮浸提量的影響。由圖4可知,隨著浸提液用量的增加,總黃酮浸提量總體上有增大趨勢,當(dāng)料液比為1∶25(g/mL)時總黃酮浸提量達(dá)到最大,之后則隨著浸提液用量的增加,總黃酮浸提量減小。浸提液用量增加,黃酮物質(zhì)溶解析出增加,但達(dá)到閾值后,提取量減少,此外,提取成本也增加。因此1∶25(g/mL)為最優(yōu)料液比。

    圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對大麻葉總黃酮浸提量的影響Fig.3 The effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids from hemp leaves

    圖4 料液比對大麻葉總黃酮浸提量的影響Fig.4 The effect of soild-to-liquid ratio on the yield of flavonoids from hemp leaves

    2.2.4 提取溫度對大麻葉總黃酮浸提量的影響

    以1∶25(g/mL)料液比加入 80&乙醇,在不同提取溫度(50、60、70、80、90℃)下水浴提取2.0 h,提取1次,測定不同提取溫度對大麻葉總黃酮浸提量的影響。由圖5可知,提取溫度在50~80℃時,隨著溫度升高,總黃酮浸提量增加,在80℃時總黃酮浸提量達(dá)到最高。當(dāng)提取溫度高于80℃時,總黃酮浸提量下降。這可能是由于溫度升高導(dǎo)致分子運(yùn)動增加,黃酮與溶劑接觸增加,故提取量升高,而過高的溫度會導(dǎo)致黃酮被氧化,導(dǎo)致提取量降低[27]。因此,80℃是最優(yōu)提取溫度。

    圖5 提取溫度對大麻葉總黃酮浸提量的影響Fig.5 The effect of extraction temperature on the yield of flavonoids from hemp leaves

    2.2.5 提取次數(shù)對大麻葉總黃酮提取量的影響

    以1∶25(g/mL)料液比加入80&乙醇,在80℃水浴鍋中,提取4次,測定不同提取次數(shù)對大麻葉總黃酮提取量的影響。由圖6可知,隨著提取次數(shù)的增加,總黃酮浸提量逐次減小,提取3次后總黃酮浸提取量幾乎不再增加。因此,本研究中最佳提取次數(shù)為2次。

    圖6 提取次數(shù)對大麻葉總黃酮提取量的影響Fig.6 The effect of extraction times on the yield of flavonoids from hemp leaves

    2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

    2.3.1 響應(yīng)面結(jié)果分析

    利用Design-Expert8.0軟件的Box-Behnken設(shè)計[28],以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比和提取溫度為自變量,總黃酮浸提量為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面分析,結(jié)果見表2。對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合,建立提取工藝參數(shù)回歸模型?;貧w方程為:Y=14.21+1.38A+1.34B+0.84C+0.88D+0.18AB-2.73AC-0.65AD+0.83BC-0.24BD+0.062CD-1.48A2-3.21B2-5.59C2-3.13D2。

    表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

    續(xù)表2

    模型的決定系數(shù)R2=0.9105,校正系數(shù),說明該模型能解釋82.10&響應(yīng)值的變化,與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好,表明該模型可以對總黃酮浸提量結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。由回歸方程各項方差分析中F檢驗(yàn)可以判斷自變量對因變量的影響。由表3可知,模型的p<0.0001,表明方程擬合極顯著;模型失擬項不顯著p>0.05。A的一次項,B、C、D的二次項、交互項AC,對應(yīng)的p值遠(yuǎn)小于0.01,對試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著;B的一次項、A的二次項對應(yīng)的p值小于0.05,對試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著。此外,還可得出,試驗(yàn)中各因素對黃酮浸提量影響的主次順序?yàn)椋篈>B>D>C,即乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響最大,其次是提取時間和提取溫度,最后是料液比。

    表3 回歸方程及方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

    2.3.2 交互作用的影響

    通過Box-Behnken試驗(yàn)得到多元二次回歸模型所作的響應(yīng)面圖,響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值與各試驗(yàn)因素(乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度)所構(gòu)成的三維空間曲面圖。在其他試驗(yàn)因素固定不變的情況下,考察交互項對浸提量的影響,即乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度、提取時間與料液比、提取時間與提取溫度、提取溫度與料液比的交互作用對大麻葉總黃酮浸提量的影響,如圖7所示。

    響應(yīng)面坡度越陡,表明響應(yīng)值對于操作條件的改變越敏感,該因素對黃酮得率的影響越大;反之則表明因素對黃酮得率的影響越小。在交互項對得率的影響中,料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)之間交互作用明顯,其他因素之間交互作用不明顯,這與方差分析的結(jié)果一致。

    2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    通過Design-Expert8.0軟件對回歸方程進(jìn)行多次擬合優(yōu)化,得出最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)50&,提取時間2.0 h,料液比 1∶20(g/mL),提取溫度 70℃,總黃酮浸提量預(yù)測值為14.21 mg/g。按1.3.2的方法進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),平行3次,測得總黃酮平均浸提量為14.28 mg/g,與預(yù)測值14.21 mg/g的誤差為0.5&左右,說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)可靠,具有實(shí)際應(yīng)用價值。

    2.5 總黃酮抗氧化活性分析

    2.5.1 FRAP法測定總抗氧化能力

    如圖8 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線所示,隨著FeSO4溶液濃度增加,F(xiàn)e2+-TPTZ增多,測定的吸光度值A(chǔ)593增加。它們之間存在線性關(guān)系。大麻葉總黃酮提取液與FRAP工作液反應(yīng)后測得A593的3次重復(fù)值分別為0.409、0.400、0.401,平均值為0.403,與 1.288 mmol/L FeSO4溶液的吸光度A593值相同,表明該總黃酮的抗氧化能力為1.288 mmol/L。

    2.5.2 ABTS法測定總抗氧化能力

    ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS自由基,而在抗氧化物存在時自由基的產(chǎn)生會被抑制。黃酮抑制ABTS自由基產(chǎn)生的能力可以表示其總抗氧化能力,用相對抗氧化劑Trolox的抗氧化能力表示。如圖9 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線,Trolox濃度越高,ABTS自由基的量則越少,吸光度A414也越小。擬合方程:y=-1.1226x+0.8032,R2=0.9973。大麻葉總黃酮提取液與工作液反應(yīng)后測得的吸光度A4143次重復(fù)值分別為0.705、0.644、0.618??傸S酮清除ABTS自由基的總抗氧化能力相當(dāng)于0.391 mmol/L的Trolox。

    圖8 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curve of FeSO4

    圖9 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Standard curve of Trolox

    2.5.3 DPPH自由基清除活性的測定

    由圖10(a)可知,隨著樣品總黃酮濃度的增加,DPPH清除能力增加。在黃酮樣品濃度達(dá)到0.008 mg/mL時,DPPH清除率達(dá)到100&,這表明黃酮清除DPPH自由基的能力與黃酮質(zhì)量濃度間存在量效關(guān)系,擬合方程為y=12576x+3.3166,R2=0.9952。陽性對照VC對DPPH自由基清除能力如圖10(b),擬合方程為y=21414x+0.9749,R2=0.9985。大麻葉總黃酮對DPPH自由基的半抑制濃度IC50為3.7μg/mL,對比VC對DPPH自由基的清除能力(IC50=2.3μg/mL),可知黃酮清除DPPH自由基能力低于VC。

    圖10 大麻葉總黃酮(a)和VC(b)對DPPH自由基清除能力Fig.10 DPPH radical-scavenging activities of flavonids from hemp leaves(a)and VC(b)

    3 小結(jié)

    本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化了回流法提取大麻葉中總黃酮的工藝,得到最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)50&、料液比1∶20(g/mL)、提取時間2.0 h、提取溫度70℃,在此條件下大麻葉總黃酮浸提量為14.28 mg/g。FRAP法、ABTS法以及DPPH自由基清除試驗(yàn)結(jié)果表明,大麻葉總黃酮提取物具有一定的抗氧化能力。該研究結(jié)果為大麻葉總黃酮的提取提供了參考,同時為大麻葉提取物的生物活性研究提供了前期基礎(chǔ)。本研究僅針對大麻葉總黃酮的提取及抗氧化能力進(jìn)行了研究,大麻葉中黃酮化合物的組成仍需進(jìn)一步探索。今后可圍繞大麻葉中黃酮成分的鑒定、抗氧化應(yīng)激以及其它生物作用機(jī)理等方面進(jìn)行探究,為大麻葉的多用途開發(fā)利用提供更為科學(xué)可靠的依據(jù)和參考。

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