miR-140-5p在骨肉瘤中的表達及其對骨肉瘤細胞侵襲轉移的影響

孫玉秀，邱 月，項博文，汪忠淼，秦寶麗

0 引言

骨肉瘤是好發(fā)于青少年長骨干骺端的惡性程度極高的原發(fā)性骨腫瘤，其發(fā)病率占全部青少年惡性腫瘤的2.4%[1-2]。骨肉瘤的生物學特性包括生長迅速、侵襲能力強、遠處轉移早等，因此，骨肉瘤患者的預后較差，并伴有較高的致死率和致殘率[1]。有報道，骨肉瘤的5年生存率極低，約為30%～75%，而且約有80%的患者在臨床上被確診為骨肉瘤時，往往已發(fā)生了肺部或其他部位的轉移[3-4]。盡管目前外科切除、腫瘤假體置換、化療放療等綜合治療改善了部分骨肉瘤患者的生存時間，但總體來看，骨肉瘤患者的平均生存期仍然較短[5-6]。目前，對于骨肉瘤的治療的總體思路仍主要局限在針對腫瘤整體，通過腫瘤整體切除并輔助化療的方式，殺死大多數(shù)骨肉瘤細胞，但患者的復發(fā)率和轉移率仍得不到良好的控制。目前，基因療法為腫瘤治療提供了新的思路，有針對性地研究骨肉瘤侵襲轉移的具體發(fā)生機制，找到能夠調控骨肉瘤侵襲轉移的關鍵因子并明確其作用機制，從而在基因水平調控骨肉瘤的侵襲轉移，具有深遠的理論意義和重要的實際價值。

微小RNA (microRNAs，miRNAs)是一類長度約為20～24 nt的小分子非編碼RNA。miRNAs在個體發(fā)育、細胞分化、增殖及凋亡等生理活動以及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等病理過程中均具有重要的調控作用[7-8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA140-5p (microRNA-140-5p，miR-140-5p)在神經(jīng)膠質瘤、胃癌、非小細胞肺癌、膀胱癌等多種腫瘤中表達失常，并與腫瘤的多種生物學行為密切相關[9-11]。目前，關于miR-140-5p在骨肉瘤中的研究不多。本研究探討miR-140-5p在骨肉瘤組織及細胞中的表達情況，并研究其對骨肉瘤細胞侵襲轉移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞株MG-63及U2OS購自中科院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR試劑盒及LipofectamineTM3000轉染試劑盒購于美國Invitrogen公司；SYBR Master Mixture購自大連Takara公司；特異性miR-140-5p探針由上海吉瑪基因公司設計合成；免疫原位雜交試劑盒購于美國BioChain公司；miR-140-5p mimics及NC mimic購于廣州銳博公司；Transwell小室購于美國Corning公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細胞株MG-63、U2OS置于DMEM培養(yǎng)基中，人成骨細胞系hFOB1.19細胞置于DMEM/F12培養(yǎng)基中，各培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素。MG-63、U2OS置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，hFOB1.19置于34 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合率達80%時，以0.25%胰蛋白酶消化并傳代。

1.2.2 脂質體介導的細胞轉染 取生長狀態(tài)佳的MG-6、U2OS細胞接種于6孔板中，接種密度2×105個細胞/孔，24 h后，利用脂質體3000分別轉染50 nmol/L miR-140-5p mimics和相應的NC mimic，具體操作嚴格按照轉染試劑盒說明書進行。48 h后進行后續(xù)實驗檢測。

1.2.3 qRT-PCR檢測miR-140-5p的表達 參照Trizol試劑盒說明書提取組織及細胞的總RNA并分組標記。按照Invitrogen的試劑盒說明書進行逆轉錄反應，反應產(chǎn)物行PCR擴增，PCR過程按Invitrogen的SYBR Green實時熒光定量PCR 試劑盒說明書在熒光定量儀上進行，設定U6為內參照，引物序列如下：上游，5′-CAGTGGTTTTACCCTATGGTAGG-3′，下游5′-CGTGGTTCTACCCTGTGGTAG-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以miR-140-5p與U6拷貝數(shù)的比值為miR-140-5p的相對表達量。

1.2.4 免疫原位雜交檢測miR-140-5p表達 采用免疫原位雜交試劑盒檢測miR-140-5p表達，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。簡要介紹如下：含有0.5% Triton X-100的1×PBS清洗組織切片后，置入采用含有1%封閉液和miR-140-5p特異性探針的雜交液的濕盒中37 °C孵育過夜。次日，依次采用含有4×、2×、1×的0.1% Tween-20的檸檬酸鈉緩沖溶液清洗3次，每次5 min。室溫下1 × PBS清洗3次，DAPI復染，顯微鏡下觀察。

1.2.5 Transwell實驗檢測MG-63細胞侵襲轉移能力變化 具體步驟參照Transwell小室說明書。常規(guī)包被底部膜，水化；同步化各組骨肉瘤細胞，調整計數(shù)并接種，上室內加入100 μl含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；下室內加入500 μl含20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2孵育48 h。取出Transwell小室，棉簽擦去Transwell小室內部細胞，沖洗，固定，染色，倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)。每組鋪6個Transwell小室，平均值即細胞侵襲的數(shù)量。計算每組6孔的侵襲細胞數(shù)。

2 結果

2.1 miR-140-5p在骨肉瘤組織中的表達 收集42例骨肉瘤組織及相應的癌旁組織標本，采用qRT-PCR法檢測miR-140-5p的表達情況，結果顯示，相比于癌旁組織，miR-140-5p在大部分骨肉瘤組織中表達降低(37/42，88.10%)，見圖1A。同時，應用免疫原位雜交的方法檢測miR-140-5p在骨肉瘤組織中的表達情況。結果顯示，相比于癌旁組織，miR-140-5p在骨肉瘤組織中表達明顯降低(P<0.01)，見圖1B。

2.2 miR-140-5p在骨肉瘤細胞中的表達 應用qRT-PCR法檢測miR-140-5p在人成骨細胞hFOB1.19及人骨肉瘤細胞系MG-63、U2OS中的表達情況，結果顯示，相比于人成骨細胞hFOB1.19，miR-140-5p在骨肉瘤細胞系MG-63及U2OS中的表達明顯降低(P<0.01)，見圖2。結果提示，miR-140-5p在骨肉瘤中表達降低。

圖1 qRT-PCR法及免疫原位雜交法檢測miR-140-5p在骨肉瘤組織中的表達

圖2 qRT-PCR法檢測miR-140-5p在骨肉瘤細胞系中的表達

2.3 轉染miR-140-5p mimics可上調MG-63及U2OS細胞內miR-140-5p的表達 通過細胞轉染的方式，分別在MG-63及U2OS細胞內轉染miR-140-5p mimics以上調其表達水平，并通過qRT-PCR法進行確認。結果顯示，與NC mimics組比較，轉染miR-140-5p mimics后，MG-63及U2OS細胞內miR-140-5p的表達水平明顯升高(P<0.01)，提示轉染成功。見圖3。

圖3 轉染miR-140-5p mimics后，miR-140-5p在骨肉瘤

2.4 上調miR-140-5p可抑制骨肉瘤細胞MG-63及U2OS侵襲轉移 通過Transwell實驗檢測上調miR-140-5p對骨肉瘤細胞MG-63及U2OS侵襲轉移能力的影響。結果顯示，上調miR-140-5p后，MG-63及U2OS細胞的侵襲轉移能力明顯減弱(P<0.01)。見圖4。

圖4 上調miR-140-5p可抑制骨肉瘤細胞MG-63、U2OS侵襲轉移

3 討論

非編碼RNA(Non-coding RNA)是指不編碼蛋白質的一大類RNA，其共同特點是均由基因組上轉錄而來，但是不具備翻譯蛋白的功能，而在RNA水平上能行使各自的生物學功能，參與表觀遺傳調控[12]。作為目前非編碼RNA領域的一個研究熱點，miRNAs是在真核生物體內廣泛存在的一大類在進化上高度保守的非編碼小分子單鏈RNA[13]。每個獨立的miRNA都可以調控若干靶基因，創(chuàng)立一個復雜的基因調節(jié)網(wǎng)絡[14]。miRNA存在的廣泛性和多樣性決定了其具有復雜、廣泛、多樣的生物學功能。研究表明，miRNA在多種腫瘤組織中常異常表達，起到了關鍵的癌基因或抑癌基因的作用[15]。

MiR-140-5p又稱miR-140，位于人染色體16q22.1，全長共含有22個核苷酸，含有1個外顯子。既往研究表明，miR-140-5p在多種腫瘤中均發(fā)揮了重要作用。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p在結直腸癌組織及細胞系中表達降低，其在結腸癌增殖侵襲轉移過程中可作為腫瘤抑制基因。Lan等[17]報道，miR-140-5p在卵巢癌中表達降低，上調其表達水平可抑制卵巢癌細胞的增殖能力并促進凋亡的發(fā)生。本研究首先關注了miR-140-5p在骨肉瘤中的表達情況。通過qRT-PCR及免疫原位雜交的方式，結果表明，相比于癌旁組織，miR-140-5p在骨肉瘤組織中表達明顯降低。進一步的細胞學水平檢測顯示，相比于人成骨細胞系hFOB1.19，miR-140-5p在骨肉瘤細胞系MG-63及U2OS中表達同樣降低。以上組織學及細胞學水平的檢測結果證實，miR-140-5p在骨肉瘤中表達降低，初步提示miR-140-5p可能是骨肉瘤的抑癌基因。

目前，關于miRNAs與腫瘤侵襲轉移的研究很多。Jing等[18]在一項下咽鱗狀細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p在下咽鱗狀細胞癌中表達減少，上調其表達水平可通過抑制亞當金屬肽酶結構域10(ADAM metallopeptidase domain 10，ADAM10)表達的方式抑制FaDu細胞的侵襲轉移。Yang等[19]研究顯示，miR-140-5p在肝細胞癌組織及6個肝細胞癌細胞系中表達減少，miR-140-5p可通過抑制轉化生長因子β (Transforming growth factor β，TGF-β)和促分裂原激活蛋白酶/細胞外信號調節(jié)激酶(Mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK)的方式抑制肝細胞癌細胞侵襲、轉移及增殖。同時，在細胞學水平關注了miR-140-5p對骨肉瘤細胞MG-63及U2OS侵襲轉移的影響。本研究首先通過細胞轉染的方式，將miR-140-5p mimics轉染至MG-63及U2OS細胞中，以構建miR-140-5p過表達的細胞模型，并通過qRT-PCR法確認轉染成功；進一步通過Transwell實驗，考察不同miR-140-5p表達水平對2種骨肉瘤細胞侵襲轉移能力的影響。結果顯示，上調miR-140-5p后，MG-63及U2OS細胞的侵襲轉移能力下降。結果表明，miR-140-5p可抑制骨肉瘤細胞MG-63及U2OS細胞的侵襲轉移。

骨肉瘤的侵襲轉移是一個涉及多通路、多因子、多機制的復雜的生物學行為過程。本研究僅僅初步探討了miR-140-5p在骨肉瘤細胞的表達及其對骨肉瘤細胞侵襲轉移的影響。MiRNAs的下游靶基因眾多，調控機制較為復雜，miR-140-5p通過調控哪些與侵襲轉移密切相關的靶基因及其參與骨肉瘤侵襲轉移的具體機制仍需深入研究。