麗水錐栗林下大型真菌生態(tài)調(diào)查及分子鑒定

薛振文 高鳳娟 應(yīng)國華 呂明亮 李伶俐

（1麗水市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江麗水323000；2麗水學(xué)院，浙江麗水323000）

錐栗[Castanea henryi（Skam）Rehd.et Wils.]殼斗科（Fagaceae）栗屬，是浙西南尤其是浙江慶元縣的主要的經(jīng)濟(jì)樹種，栽培面積達(dá)4000 hm2。錐栗是菌根共生樹種之一，在天然錐栗林中有菌根菌與之共生，形成互惠互利關(guān)系。目前生產(chǎn)中錐栗育苗主要采用實(shí)生苗培育后嫁接良種的繁殖方法，苗木質(zhì)量參差不齊，優(yōu)質(zhì)苗木比例低，造林成活率低，幾乎沒有采用菌根技術(shù)接種菌根菌進(jìn)行菌根苗的培育方式。研究擬通過錐栗林下外生菌根真菌種類的調(diào)查及與錐栗共生關(guān)系的研究，篩選出能與錐栗共生的菌根真菌種類，確定優(yōu)勢菌根菌，為錐栗菌根苗的生產(chǎn)應(yīng)用和開發(fā)利用菌根菌奠定基礎(chǔ)。

1 生態(tài)調(diào)查

1.1 生態(tài)條件

試驗(yàn)調(diào)查地浙江麗水市慶元縣嶺頭鄉(xiāng)包裹村（海拔 1111 m，地理坐標(biāo)為 27°32′23.25″N，119°14′21.34″E）和屏都街道余村（海拔409 m，地理坐標(biāo)為 27°35′48.2″N，118°59′10.9″E）錐栗人工純林。錐栗品種為油榛、黃榛、烏殼長芒等優(yōu)良家系，樹齡14～18年，盛產(chǎn)期；錐栗距地面10 cm處的直徑15.6 cm±3.4 cm，樹高6.2 m±1.4 m，郁閉度0.7～0.8。林地土壤為紅壤。當(dāng)?shù)貙賮啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，年平均氣溫17.6℃，最熱月（7月）平均氣溫26.9℃，最冷月（1月）平均氣溫7℃，年平均降水量1746.9 mm，年均相對濕度77%，年平均無霜期255 d。

1.2 生態(tài)調(diào)查方法

沿路踏查選擇三塊大型真菌子實(shí)體較多的樣地，對每塊樣地采用普查方式進(jìn)行研究。采用羅盤儀測量法測定樣地面積，采集樣地內(nèi)大型真菌、分類編號A-F、統(tǒng)計(jì)數(shù)量、記錄和拍照。為證實(shí)子實(shí)體與錐栗是否共生關(guān)系，采集時(shí)沿子實(shí)體基部小心挖開表面土壤，在土壤的菌絲層中，仔細(xì)尋找菌絲或菌索來確認(rèn)與錐栗根系相連，挖取20 cm×20 cm×20 cm帶土根系帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)挑取菌根觀察形態(tài)。

2 分子鑒定材料與方法

2.1 分子鑒定材料

待分子鑒定的子實(shí)體編號為A、B、C、D。

2.2 分子鑒定方法

2.2.1 DNA的提取

采用改良的CTAB法[1]提取DNA，得到的DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。

2.2.2 PCR擴(kuò)增

采用真菌rRNA基因的ITS區(qū)擴(kuò)增通用引物ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）; 和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’）進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增[2]。PCR 擴(kuò)增體系包括（25 μL）：DNA 模板2 μL，引物ITSIF和ITS4各0.5 μL，10×PCR 緩沖液 2.5 μL，dNTPs 2 μL，rTaq 聚 合 酶 0.125 μL，ddH2O 25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；54℃退火30 s；72℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳分離，并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并照相。

2.2.3 rDNA ITS序列測定與分析

上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物送金斯瑞測序公司進(jìn)行測序。對測得的供試菌株rDNA ITS區(qū)段DNA序列運(yùn)用GenBank中的BLAST工具軟件在DNA序列數(shù)據(jù)庫中搜索同源DNA序列并進(jìn)行比較分析，根據(jù)BLAST搜索和比較的結(jié)果，判斷真菌的物種或與其近緣的物種。

3 結(jié)果與分析

3.1 生態(tài)調(diào)查

對分布于海拔400～1100 m的錐栗林調(diào)查發(fā)現(xiàn)有6種大型真菌。經(jīng)菌索追蹤發(fā)現(xiàn)橙黃硬皮馬勃、芝麻厚瓤牛肝菌、雙型褶孔牛肝菌均與錐栗根系相連，可初步確定為菌根菌。橙黃硬皮馬勃是錐栗林最常發(fā)生的外生菌根菌，于6-10月發(fā)生，海拔越高馬勃發(fā)生越遲。充足降雨之后，連續(xù)3～5 d的高溫天氣子實(shí)體會大量發(fā)生。

圖1 標(biāo)本A橙黃硬皮馬勃Scleroderma citrinum

圖2 標(biāo)本B芝麻厚瓤牛肝菌Hourangia nigropunctata

圖3 標(biāo)本C雙型褶孔牛肝菌Phylloporus dimorphus

圖4 標(biāo)本D蠟?zāi)⑽粗N

圖5 標(biāo)本E 黑柄炭角菌Xylaria nigripes（Kl.）Sacc.

圖6 標(biāo)本F雞Termitornyces sp.

為了研究菌根菌的優(yōu)勢種類，統(tǒng)計(jì)了三塊樣地三種菌根菌的子實(shí)體發(fā)生量（表1），橙黃硬皮馬勃發(fā)生量最多，密度達(dá)0.0875個(gè)/㎡，可以確定橙黃硬皮馬勃為調(diào)查樣地的優(yōu)勢菌根菌；調(diào)查發(fā)現(xiàn)在低海拔的錐栗林下比高海拔條件下橙黃硬皮馬勃發(fā)生密度更大，發(fā)生時(shí)間更早。芝麻厚瓤牛肝菌和雙型褶孔牛肝菌僅僅發(fā)生在高海拔1111 m錐栗林下，芝麻厚瓤牛肝菌和雙型褶孔牛肝菌發(fā)生平均密度分別為0.0343個(gè)/㎡、0.0272個(gè)/㎡，為高海拔錐栗林下較優(yōu)勢菌根菌。

表1 菌根菌發(fā)生量統(tǒng)計(jì)

調(diào)查發(fā)現(xiàn)位于屏都街道余村的錐栗林地套種黃精和竹蓀后，當(dāng)年橙黃硬皮馬勃子實(shí)體發(fā)生量顯著減少，且均發(fā)生于未耕作的邊坡。第四年后橙黃硬皮馬勃發(fā)生量明顯增多，原因可能是松土耕作對錐栗菌根發(fā)育造成影響，從而影響橙黃硬皮馬勃子實(shí)體發(fā)生。

3.2 子實(shí)體分子鑒定

表2 子實(shí)體分子鑒定結(jié)果

Hourangia nigropunctata和Phylloporus dimorphus中文名經(jīng)咨詢楊祝良老師獲得，分別為芝麻厚瓤牛肝菌和雙型褶孔牛肝菌。子實(shí)體形態(tài)描述參見文獻(xiàn)[3，4]。

據(jù)報(bào)道[3]芝麻厚瓤牛肝菌在我國發(fā)現(xiàn)地域有云南的騰沖市，江城縣、景洪縣、湖南省宜章縣，福建省三明市，海南省樂東縣，貴州省道真縣，海拔在1300～1900 m的松屬、栲屬、石櫟屬、櫟屬林地內(nèi)。筆者在海拔1111 m的錐栗純林下發(fā)現(xiàn)該牛肝菌，首次報(bào)道栗屬的錐栗為芝麻厚瓤牛肝菌的共生樹種。據(jù)報(bào)道[4]雙型褶孔牛肝菌僅發(fā)現(xiàn)于泰國北部栲屬林地內(nèi)，筆者首次在栗屬錐栗純林下發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)未發(fā)現(xiàn)該牛肝菌的報(bào)道。

利用ITS序列分析結(jié)果表明：標(biāo)本編號為D的子實(shí)體（圖4）與酒色蠟?zāi)⑾嗨坡蕛H為76%，可能為一種近似種或新種，經(jīng)菌絲或菌索追蹤未發(fā)現(xiàn)與錐栗根系相連，子實(shí)體周圍有較厚的落葉層，推測非菌根菌。

4 結(jié)論與討論

在慶元錐栗林地調(diào)查發(fā)現(xiàn)與錐栗共生的菌根菌種類有橙黃硬皮馬勃、芝麻厚瓤牛肝菌和雙型褶孔牛肝菌。低海拔條件下菌根菌發(fā)生時(shí)間早，高海拔條件下發(fā)生時(shí)間晚且種類較多。

在高、低海拔地區(qū)，橙黃硬皮馬勃均為錐栗的優(yōu)勢菌根菌，建議采用接種有橙黃硬皮馬勃的錐栗苗造林，既能促進(jìn)錐栗生長，又能收獲橙黃硬皮馬脖子實(shí)體。

芝麻厚瓤牛肝菌或雙型褶孔牛肝菌菌種分離、擴(kuò)繁、菌根合成等技術(shù)有待繼續(xù)研究，進(jìn)而在高海拔地區(qū)營造菌根林，達(dá)到收獲子實(shí)體和促進(jìn)錐栗苗生長的目標(biāo)。

由于土壤耕作破壞錐栗根系上菌根的生長發(fā)育，橙黃硬皮馬勃發(fā)生明顯減少，而邊坡未耕作區(qū)仍然能發(fā)生子實(shí)體。

挖取的菌根經(jīng)處理后解剖鏡下挑取，觀察菌根形態(tài)，由于野生菌根種類復(fù)雜，菌根發(fā)育期菌根形態(tài)差異較大等原因無法肉眼鑒定出菌根菌類型，需要借助分子手段，有待繼續(xù)研究。