我國不同地區(qū)熊蜂短膜蟲的感染情況及親緣關系

唐裕杰，王劉豪，李凱，李繼蓮

（中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲生物學重點實驗室，北京100093）

0 引言

【研究意義】熊蜂（Bombusspp.）是自然生態(tài)系統(tǒng)中重要的授粉昆蟲，在維持自然界和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)平衡方面發(fā)揮著至關重要的作用。我國是全世界熊蜂種類最豐富的國家之一[1-2]。目前全球已知的熊蜂種類約250種[3]。我國已知的熊蜂種類多達125種，約占全球熊蜂已知物種的 50%[4]。熊蜂具有個體大、壽命長、吻較長、全身密被絨毛等特點，采集能力強于蜜蜂，對弱光、低溫等較惡劣的環(huán)境條件有良好的適應能力[5]。目前，我國飼養(yǎng)熊蜂的主要用途是為設施農(nóng)業(yè)、大田作物、果蔬等授粉，同時也對外出口至其他國家[6]。商品化熊蜂群的應用規(guī)模越來越大，其在不同國家間的進出口不可避免會傳播部分病原蟲害，其中寄生蟲是影響熊蜂生態(tài)分布和商業(yè)化發(fā)展的主要因素。熊蜂短膜蟲（Crithidia bombi）是危害熊蜂健康的常見寄生蟲之一，其主要寄生于熊蜂腸道內(nèi)，且傳播廣泛、數(shù)量多，對熊蜂的繁育與產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)生巨大的影響[7-8]。在野外環(huán)境中，熊蜂可能會從巢內(nèi)的同伴或在被污染的花上覓食的同伴處感染這種寄生蟲[9]。研究熊蜂短膜蟲的感染情況，關注熊蜂健康，保護熊蜂的物種多樣性，對更好地保護生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】熊蜂短膜蟲屬于動鞭毛蟲綱、動質目、錐蟲亞目、短膜蟲屬，其形態(tài)特點為只有錐蟲亞目6個發(fā)育期中的無鞭毛期和前鞭毛期，無鞭毛期是隨昆蟲糞便排出的感染期，而前鞭毛期為腸道寄生期[10]。早期的研究報道證實，在熊蜂腸道中發(fā)現(xiàn)了短膜蟲屬的Crithidia bombi和細滴蟲屬的Leptomonassp.。武文杰認為自然界中的熊蜂短膜蟲存在著多重感染的現(xiàn)象；熊蜂短膜蟲對熊蜂的成活率有較為明顯的影響，且不同株的短膜蟲對熊蜂的影響不同[11-13]。在真核生物的核糖體中，內(nèi)轉錄間隔區(qū)（internal transcribed space，ITS）位于18S和5.8S rDNA之間以及5.8S和28S rDNA之間，故ITS區(qū)包括ITS-1區(qū)和ITS-2區(qū)。因為ITS區(qū)域兩端分別為大亞基和小亞基，所以不像rRNA基因一樣受到功能上的限制，且 18S、5.8S和28S基因組序列在絕大多數(shù)的生物中趨于保守，在生物種間變化相對較小，穩(wěn)定性強，而ITS區(qū)域進化速度較編碼區(qū)快，在核苷酸序列和長度上也存在很強的變異性[14-16]。基于這些特點，ITS區(qū)域成為許多寄生蟲分子分類學研究的有用標記。ZHU等[17]通過對 15種蛔蟲rDNA的ITS-1區(qū)和ITS-2區(qū)進行測序，發(fā)現(xiàn)了不同種的ITS序列存在不同程度的差異，進而分析了15種蛔蟲的系統(tǒng)進化；張立海等[18]利用2個引物擴增松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）和擬松材線蟲（B. mucronatus）的ITS序列，得到ITS-1區(qū)的擴增產(chǎn)物大小約308 bp，該區(qū)可作為松材線蟲PCR鑒定的靶向序列，并測出這兩個種間的ITS序列差異為32—39 bp，而松材線蟲種內(nèi)差異不超過1 bp；周榮瓊等[19]通過對國內(nèi) 3株安氏隱孢子（Cryptosporidium andersoni）的ITS-1序列進行擴增并分析，發(fā)現(xiàn)3株安氏隱孢子的ITS-1序列基本一致，僅其中1株與其他2株有3個堿基的差異，與GenBank注冊的C. muris和C. parvum存在種間差異，且差異顯著，這充分說明了ITS-1序列可以作為C. andersoni種的遺傳標記，從而為隱孢子蟲屬的種間鑒定打下了基礎；鄒志文等[20]研究發(fā)現(xiàn)，ITS序列片段分析結果支持尼氏真綏螨（Euseius nicholsi）和卵圓真綏螨（E. ovalis）現(xiàn)在的分類地位，而小新綏螨屬與鈍綏螨屬似乎未達到屬間差異，其分類地位有待進一步確定；艾琳等[21]擴增了黑龍江絨山羊和綿羊的東畢吸蟲（Orientobilharziaspp.）的ITS序列，發(fā)現(xiàn)這兩種東畢吸蟲的ITS序列總長度均為875 bp，且序列相似性為99.9%，證實了黑龍江絨山羊和綿羊的東畢吸蟲為同一個種；LIU等[22]通過測得不同牛梨形蟲ITS序列來構建牛梨形蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)所有的牛巴貝斯蟲和泰勒蟲各獨立占有一支，故通過ITS序列差異來反映這些種的親緣關系更為理想。上述研究均證實了隨著分子生物學技術的發(fā)展，rDNA-ITS序列分析已經(jīng)廣泛應用于原蟲和蠕蟲等寄生蟲的分類、鑒定、診斷和系統(tǒng)發(fā)育的研究，且能夠取得很好的效果?！颈狙芯壳腥朦c】近年來我國關于熊蜂短膜蟲的研究報道相對缺乏。本研究利用特異的ITS引物擴增待檢測的熊蜂腸道總DNA，之后進行凝膠電泳，通過是否擴增出675 bp的熊蜂短膜蟲ITS基因片段來判斷待檢測的蜂群是否感染了熊蜂短膜蟲，通過進一步測序，分析不同蜂種、不同地區(qū)寄生的熊蜂短膜蟲之間的親緣關系?！緮M解決的關鍵問題】調查研究我國內(nèi)蒙古、甘肅、青海、四川4個?。ㄗ灾螀^(qū)）熊蜂短膜蟲的感染率，并由其序列同源性構建系統(tǒng)發(fā)育樹，旨在進一步探究我國部分地區(qū)短膜蟲的流行規(guī)律及不同地區(qū)、不同蜂種間寄生的短膜蟲的親緣關系，為商品化熊蜂的短膜蟲病的進出口檢疫以及熊蜂短膜蟲的分類鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 熊蜂樣本采集

供試熊蜂樣本均于2017年7—8月采自內(nèi)蒙古、甘肅、青海、四川等地。在采集樣本時，將捕蟲網(wǎng)捕獲得到的熊蜂置于無水乙醇中，妥善保存熊蜂樣本，同時記錄采集地區(qū)的海拔高度和經(jīng)緯度（表 1）。之后對不同蜂種、不同地區(qū)熊蜂短膜蟲的感染率進行卡方檢驗分析（SPSS 22.0）。

1.2 熊蜂腸道總DNA提取

將采樣保存的熊蜂解剖，取其中腸后放入1.5 mL的離心管中，10 000×g離心2 min，收集離心管下方的沉淀物。向沉淀中依次加入500 mmol·L-1的NaCl 60 μL、100 mmol·L-1的 Tris-HCl（pH 8.0）30 μL、50 mmol·L-1的 EDTA（pH 8.0）150 μL、10%的 SDS 溶液 30 μL、50 μg·μL-1蛋白酶 K 溶液 30 μL，并混勻，然后在液氮中反復凍融3次，55℃水浴48 h。消化好的懸液按DNA提取試劑盒（Wizard ? SV 96 Genomic DNA Purification System，Promega）的操作步驟提取熊蜂腸道的基因組DNA，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計和PCR擴增

利用ITS引物Cri-its-b12及Cri-its-f4擴增熊蜂短膜蟲 ITS序列[23]，上游引物 Cri-its-b12序列為5′-AGGAAGCCAAGTCATCCATCGC-3′，下游引物Cri-its-f4 序列為 5′-GGTCTATGTGATTCCGTGGTTT CC-3′，由華大基因公司合成。PCR反應體系為25 μL，包括 5 μL 的 5×GoTaq Buffer、1.5 μL 的 MgC12（25 mmol·L-1，Promega公司），2.0 μL的dNTPs（200 μmol·L-1，TaKaRa公司），引物 Cri-its-b12和引物 Cri-its-f4各 1 μL（10 μmol·L-1），0.625 U/管的 GoTaq DNA 聚合酶，5 μL 的模板 DNA（約 5 ng·μL-1），8.875 μL 的ddH2O。反應在Eppendorf Master cycler PCR儀上進行。反應參數(shù)：預變性95℃ 4 min，變性95℃ 1 min，退火64℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，循環(huán)32次，最后延伸 72℃ 10 min。之后進行電泳檢測條帶有無，2%的瓊脂糖凝膠，GlodView核酸染料染色，在10 g·L-1的TAE電泳液中電泳，全自動凝膠成像系統(tǒng)成像并拍照留存。

1.4 ITS基因片段克隆與測序

1.4.1 PCR產(chǎn)物與載體的連接 利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209，天根生化科技有限公司）切膠回收PCR擴增產(chǎn)物，然后再在PCR管中依次加入PCR純化產(chǎn)物1—3 μL（根據(jù)產(chǎn)物濃度而定）和pMD19-T載體1 μL，然后加ddH2O至5 μL，即總量為5 μL，最后加入 Solution I溶液 5 μL，混勻，16℃反應 30 min。

1.4.2 連接產(chǎn)物的轉化 從-80℃冰箱取出感受態(tài)細胞，輕輕放置在冰浴環(huán)境中使其融化；緩慢地加入目的DNA，輕輕上下顛倒混勻，冰浴30 min，42℃水浴熱激30 s，然后快速轉移，冰浴2—3 min，該過程避免離心管劇烈搖晃；然后向離心管中加入500 μL不含氨芐的LB液體培養(yǎng)基，混勻，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，200 r/min培養(yǎng)1 h，待細胞復蘇；吸取已轉化的感受態(tài)細胞加入到含氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，涂板，使細胞均勻地分布于平板上，再將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.4.3 菌液 PCR 取陽性重組菌落的菌液接種于含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，然后取一定量的菌液進行PCR擴增。反應的總體系為25 μL，反應參數(shù)：預變性95℃ 4 min，變性95℃ 1 min，退火64℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，循環(huán)32次，最后延伸72℃ 10 min。然后進行電泳檢測條帶有無，

2%的瓊脂糖凝膠，GlodView染料染色，在10 g·L-1的TAE電泳液中電泳，全自動凝膠成像系統(tǒng)成像并攝像。

表1 各地區(qū)所調查的熊蜂的種類和數(shù)量Table 1 The species and number of bumblebees in different regions

1.4.4 重組質粒的抽提及酶切鑒定 經(jīng)過菌液 PCR篩選出來陽性克隆菌株后，采用質粒小提試劑盒（DP103，天根生化科技有限公司）抽提重組質粒，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定。

1.4.5 熊蜂短膜蟲 ITS序列的測序 將經(jīng)過菌液PCR方法篩選，以及重組質粒酶切鑒定后的陽性菌落送至北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。ITS基因片段的測序結果采用BioEdit編輯，并進行Blast比對分析，用DNAman 9.0對分離的rDNA-ITS序列進行分析比較，MEGA 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹以確定短膜蟲的系統(tǒng)進化[24-26]。

2 結果

2.1 不同種熊蜂的短膜蟲感染情況

檢測了25種熊蜂的短膜蟲感染情況，共計1 007只。檢測到感染短膜蟲的熊蜂有20種，共計262只，感染率為26.0%，樣本量在30只以上的熊蜂有表2所示8種。其中白背熊蜂與火紅熊蜂的短膜蟲感染率極顯著高于其他6種熊蜂（P＜0.01），而西伯熊蜂的短膜蟲感染率極顯著低于其他7種熊蜂（P＜0.01）。

表2 不同種熊蜂的短膜蟲感染情況Table 2 Infection situations of C. bombi in different bumblebee species

2.2 同一地區(qū)不同種熊蜂的短膜蟲感染情況

在調查的熊蜂中，對樣品數(shù)≥30只的熊蜂短膜蟲感染率進行分析比較（表3），四川的弗里熊蜂、疏熊蜂、興熊蜂的短膜蟲感染率依次為 27.1%、20.1%和15.0%，且這3種熊蜂感染率無顯著性差異（P＞0.05）；而白背熊蜂的短膜蟲感染率為70.0%，極顯著高于前3種熊蜂（P＜0.01）。甘肅的密林熊蜂和紅束熊蜂的短膜蟲感染率依次為 23.1%和14.6%，且這兩種熊蜂感染率差異不顯著（P＞0.05）。內(nèi)蒙古的密林熊蜂的短膜蟲感染率為 12.2%，而西伯熊蜂未發(fā)現(xiàn)感染，故密林熊蜂的感染率極顯著高于西伯熊蜂（P＜0.01）。

表3 同一地區(qū)不同種熊蜂的短膜蟲感染情況Table 3 Infection situations of C. bombi of different bumblebee species in the same region

2.3 同種熊蜂在不同地區(qū)的短膜蟲感染情況

由表4可以看出，同種熊蜂在不同地區(qū)感染的短膜蟲感染率之間差異均不顯著。密林熊蜂在內(nèi)蒙古的短膜蟲感染率為 12.2%，在甘肅為 23.1%；火紅熊蜂在甘肅的短膜蟲感染率為 68.4%，在青海為 63.6%，兩個省份的差異雖不顯著，但火紅熊蜂的短膜蟲感染率在這兩個省份均較高；穩(wěn)紋熊蜂在甘肅和青海兩個省份均未發(fā)現(xiàn)感染。另外從表1可以看出，跨3個地區(qū)分布的明亮熊蜂雖然總的樣本量不多，但感染率均較高。

2.4 不同地區(qū)熊蜂的短膜蟲感染情況

由表5可以看出，青海、四川、甘肅、內(nèi)蒙古4個地區(qū)的熊蜂短膜蟲感染率分別為 48.2%、28.0%、22.0%、10.2%。其中青海的短膜蟲感染率最高，且極顯著高于其他3個地區(qū)（P＜0.01）；內(nèi)蒙古的短膜蟲感染率最低，且極顯著低于其他3個省份（P＜0.01）。

2.5 不同級型熊蜂的短膜蟲感染情況

由表6可以看出，雄蜂和工蜂的短膜蟲感染率分別為44.7%、24.5%，蜂王未發(fā)現(xiàn)感染。其中，雄蜂的感染率極顯著高于其他兩種級型（P＜0.01）。

表4 同種熊蜂在不同地區(qū)的短膜蟲感染情況Table 4 Infection situations of C. bombi of the same bumblebee species from different regions

表5 不同地區(qū)熊蜂的短膜蟲感染情況Table 5 Infection situations of C. bombi from different regions

表6 不同級型熊蜂的短膜蟲感染情況Table 6 Infection situations of C. bombi from different castes

2.6 感染熊蜂的短膜蟲親緣關系

基于 NJ算法構建不同地區(qū)熊蜂感染的短膜蟲的親緣關系（圖1）。甘肅地區(qū)檢測的9種熊蜂中，有7種熊蜂感染的短膜蟲親緣關系較近，而另外2種親緣關系較遠，分別為黑尾熊蜂和猛熊蜂。內(nèi)蒙古地區(qū)檢測的3種熊蜂感染的短膜蟲親緣關系均較近。青海地區(qū)檢測的4種熊蜂短膜蟲親緣關系均較近。四川地區(qū)較為復雜，疏熊蜂、興熊蜂和弗里熊蜂感染的短膜蟲種類不一，感染的短膜蟲親緣關系既與整體保持一致性，又有各自特殊的進化分支。總體而言，大部分熊蜂感染的短膜蟲親緣關系均較近，除了甘肅的黑尾熊蜂和猛熊蜂，四川的疏熊蜂、興熊蜂和弗里熊蜂感染的短膜蟲與其他短膜蟲親緣關系較遠。此外，還發(fā)現(xiàn)甘肅的黑尾熊蜂和四川的弗里熊蜂感染的短膜蟲親緣關系很近，部分采自四川的疏熊蜂感染的短膜蟲接近于Crithidia expoeki。

圖1 基于NJ算法構建的不同地區(qū)感染熊蜂的短膜蟲近緣種間的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of C. bombi of closely related species from different regions based on NJ algorithm

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，熊蜂短膜蟲對我國熊蜂的感染廣泛，在檢測的內(nèi)蒙古、甘肅、青海、四川4個?。ㄗ灾螀^(qū)）的25種1 007只熊蜂中，有20種262只被短膜蟲感染，其感染率為26.0%。樣本量在30只以上的8種熊蜂分別為白背熊蜂、火紅熊蜂、弗里熊蜂、疏熊蜂、密林熊蜂、紅束熊蜂、興熊蜂和西伯熊蜂，其中白背熊蜂和火紅熊蜂的短膜蟲感染率極顯著高于其他6種熊蜂，而西伯熊蜂的短膜蟲感染率極顯著低于其他 7種熊蜂，說明短膜蟲存在寄主專一性，這是由于不同種類寄主的生理生化特性和免疫特征不同[27]，以及不同基因型的短膜蟲與不同基因型的熊蜂種群間相互作用的結果。四川地區(qū)的白背熊蜂的雄蜂感染率極高，這導致雄蜂整體發(fā)病水平偏高，同時，四川地區(qū)的白背熊蜂成為最容易感染短膜蟲的蜂種，推測該地區(qū)的白背熊蜂為較易感特定種屬的短膜蟲。另外，青海地區(qū)的短膜蟲感染率最高，內(nèi)蒙古地區(qū)的短膜蟲感染率最低，這可能與不同地區(qū)熊蜂的種類有關，例如，青海地區(qū)的火紅熊蜂、明亮熊蜂、西氏熊蜂的感染率都較高，均為易感染短膜蟲的蜂種；而內(nèi)蒙古地區(qū)的西伯熊蜂的短膜蟲感染率是樣本量在 30只以上的所有蜂種中相對最低的，推測正是由于西伯熊蜂占比較大而使得內(nèi)蒙古地區(qū)的整體感染率水平相對其他省份較低。

對我國不同地區(qū)熊蜂短膜蟲感染情況的統(tǒng)計分析側重于樣本量≥30的種類，這些種類是各個地區(qū)的優(yōu)勢種。但數(shù)量少于30只的樣本也可觀察到差異，從表1可以看出，跨3個地區(qū)分布的明亮熊蜂雖然總的樣本量不多，但感染率均很高，推測明亮熊蜂亦為易感病的蜂種，因樣本量不足，有待進一步采樣檢測和驗證。根據(jù)統(tǒng)計結果也可以看出，同種熊蜂在不同地區(qū)的短膜蟲感染率差異均不顯著，但火紅熊蜂在甘肅和青海地區(qū)的感染率均遠高于其他種熊蜂水平，推測火紅熊蜂較易感染短膜蟲，這與前述結果一致；而在甘肅和青海兩個省份采集的穩(wěn)紋熊蜂樣品中均未發(fā)現(xiàn)感染短膜蟲，推測穩(wěn)紋熊蜂為較抗短膜蟲的蜂種。

YOURTH等研究發(fā)現(xiàn)，在繼代移殖短膜蟲的蜂群中，短膜蟲對熊蜂宿主的感染能力在同一蜂群內(nèi)沒有增加；在未處理的蜂群中，感染短膜蟲的工蜂數(shù)量下降，推測這種感染情況的減少很可能是由于在同一蜂群中繼代移殖短膜蟲，會逐漸喪失短膜蟲的某些株型，混合型在特定株型的連續(xù)傳代過程中被“過濾”，而沒有相應增加存活株型的整體強度[9]。在意大利和瑞士，短膜蟲感染率水平與宿主級型相關，蜂王的感染率為54%—81%，工蜂為75%—80%，雄蜂為47%—71%[28]。我國熊蜂的雄蜂和工蜂的感染率分別為44.7%和24.5%，雄蜂感染率略低于國外水平，而工蜂的感染率遠低于國外水平，說明我國熊蜂更抗短膜蟲；另外，相比于工蜂，雄蜂的短膜蟲感染率更高，說明我國短膜蟲更傾向于寄生雄蜂，這為今后防治熊蜂短膜蟲提供了理論依據(jù)。

通過對四省/區(qū)熊蜂所感染的短膜蟲的ITS序列進行測序分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古、甘肅、青海地區(qū)熊蜂感染的短膜蟲總體進化關系較為一致，同種短膜蟲在這幾個地區(qū)的感染率也相對一致，而四川與其他3個地區(qū)雖然有重疊的進化關系，但分化相對較遠。熊蜂所感染的短膜蟲間的親緣關系總體來說較強，但也受到地理位置以及其寄主熊蜂蜂種的影響。本研究取樣范圍仍不夠寬泛，我國其他省/區(qū)的短膜蟲感染情況仍不明確，故有待于進一步擴大調查研究范圍。同時，采集樣本時，對蜂王的采集較為缺乏，不具充分理由說明蜂王是否抗熊蜂短膜蟲。

4 結論

我國熊蜂廣泛感染熊蜂短膜蟲，不同蜂種、不同地理環(huán)境和不同級型間熊蜂短膜蟲的感染率均有差異，熊蜂群體經(jīng)過長期進化演變，不同地區(qū)形成優(yōu)勢種類，故不同地區(qū)所捕捉到的熊蜂種類不同。熊蜂短膜蟲存在寄主專一性，且短膜蟲對熊蜂宿主的感染具有適應性，這與不同基因型的短膜蟲種群和熊蜂種群間相互作用有關。此外，我國部分地區(qū)熊蜂感染的短膜蟲的親緣關系總體來說較強，但也受地理位置及其寄主的影響。

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