米格列奈及其3個異構(gòu)體雜質(zhì)的反相液相色譜分離及質(zhì)譜碎裂分析

李 珉, 劉海濤, 侯金鳳, 王成剛, 李文東, 車寶泉

(北京市藥品檢驗所, 中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室, 北京 102206)

米格列奈(mitiglinide),化學名為2-(S)-芐基-4-氧代-4-(順-全氫異吲哚-2-基)丁酸,是一種新型的苯甲酸衍生物類降糖藥物,2004年由日本Kissei制藥公司在日本首次上市[1,2],其化學結(jié)構(gòu)式如圖1所示。近年來,國內(nèi)外的相關(guān)文獻主要為基于反相色譜的米格列奈有關(guān)物質(zhì)的分析,以及基于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)或超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)的米格列奈含量測定方法[3-11],然而這些方法均未實現(xiàn)米格列奈異構(gòu)體的分離,且均未對米格列奈的質(zhì)譜裂解機理有任何報道。對米格列奈異構(gòu)體的分離,大多采用基于手性色譜的方法對光學異構(gòu)體進行分離[12,13]。而對米格列奈進行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),其可能存在多種非光學異構(gòu)體,這些異構(gòu)體往往沒有藥效活性,因此實現(xiàn)對其非光學異構(gòu)體的分離具有重要意義。近年來,藥物的非光學異構(gòu)體雜質(zhì)引起越來越多的關(guān)注,各種藥物的異構(gòu)體分離方法常有報道[14-20]。2014年,Sastry等[21]報道了多種米格列奈可能的異構(gòu)體雜質(zhì),其中僅包含一種非光學異構(gòu)體雜質(zhì),且研究表明其并無藥效活性。同年,周曉蘭[22]建立了可以實現(xiàn)該位置異構(gòu)體與米格列奈分離的反相液相色譜方法。本文在此基礎(chǔ)上,建立了成功分離米格列奈與3種異構(gòu)體的反相超高效液相色譜方法,并結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù),對米格列奈及其異構(gòu)體可能的裂解機理進行了推斷。

圖 1 米格列奈鈣的化學結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structure of mitiglinide calcium

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜-Q Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司),配有ESI源;XA205型電子天平(d=0.01 mg,瑞士Mettler Toledo公司); Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)。

米格列奈鈣(批號為20160501-D,純度99.95%)和米格列奈鈣消旋體對照品(批號為2016070401,純度98.7%)均由德州博誠制藥有限公司提供。甲酸、乙腈(色譜純)購自美國Merck公司,正戊醇(色譜純)購自上海麥克林生化科技有限公司。

米格列奈鈣原料樣品(批號分別為0320160401、01616015、150801、MG-161101和170401Y)分別由德州博誠制藥有限公司、連云港潤眾制藥有限公司、浙江國邦藥業(yè)有限公司、江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司和煙臺正方制藥有限公司提供。

1.2 溶液的配制

米格列奈鈣標準溶液 精密稱取米格列奈鈣對照品適量,用水-乙腈(2∶1, v/v)溶解、定容,配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的對照品儲備液,于4 ℃保存(有效期10天)。每次使用前,用水-乙腈(2∶1, v/v)逐級稀釋,配制成米格列奈質(zhì)量濃度分別為2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000和10 000 μg/L的系列標準工作溶液。

系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取米格列奈鈣對照品10.41 mg,置于100 mL容量瓶中,加適量水-乙腈(2∶1, v/v)溶解,100 ℃水浴破壞1 h,放冷至室溫,定容;精密量取1 mL,置100 mL量瓶中,用水-乙腈(2∶1, v/v)定容。

消旋體對照溶液 精密稱取米格列奈鈣消旋體對照品10.67 mg,置于100 mL容量瓶中,加適量水-乙腈(2∶1, v/v)溶解,定容。精密量取1 mL,置100 mL量瓶中,用水-乙腈(2∶1, v/v)定容,配制成質(zhì)量濃度約為1 000 μg/L的溶液。

供試品溶液 精密稱取米格列奈鈣原料樣品適量,用水-乙腈(2∶1, v/v)溶解、定容,配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的溶液。

1.3 破壞試驗操作過程

取米格列奈鈣原料約10 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,加溶劑(水-乙腈(2∶1, v/v))5 mL,超聲并時時振蕩使溶解,將上述溶液平行配制6份,記作溶液A,分別按下述條件進行破壞試驗。

酸破壞:在溶液A中加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL,于室溫下放置4 h,加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL,再加溶劑稀釋至刻度,搖勻,即得。

堿破壞:在溶液A中加入1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL,于室溫下放置4 h,加1 mol/L鹽酸溶液1 mL,再加溶劑稀釋至刻度,搖勻,即得。

氧化破壞:在溶液A中加入6%(v/v)過氧化氫溶液1 mL,于室溫下放置4 h,加溶劑稀釋至刻度,搖勻,即得。

高溫破壞:在溶液A中加溶劑稀釋至刻度,搖勻,于100 ℃水浴破壞4 h,放冷至室溫,用溶劑稀釋至刻度,搖勻,即得。

強光照破壞:在溶液A中加溶劑稀釋至刻度,搖勻,于4 500 lx光照條件下放置約4 h,取出,即得。

紫外光照破壞:在溶液A中加溶劑稀釋至刻度,搖勻,于紫外光照條件下放置約4 h,取出,即得。

1.4 儀器分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC?HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);流動相:水-乙腈-正戊醇(75∶25∶1, v/v/v),用甲酸調(diào)節(jié)pH至1.8;流速:0.4 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:10 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI;掃描模式:正離子;檢測模式:單離子監(jiān)測模式二級掃描(SIM/dd MS2);一級離子掃描范圍(m/z): 314.190 7～318.190 7;二級離子掃描范圍(m/z): 50～350;一級分辨率:70 000 FWHM;二級分辨率:17 500 FWHM;噴霧電壓:3.5 kV;離子傳輸管溫度:325 ℃;汽化溫度:350 ℃;鞘氣壓(N2): 40 arb;輔助氣壓(N2): 10 arb; S-Lens: 55 V; HCD碰撞氣:氮氣;碰撞電壓:35 eV。

表 1 米格列奈及其3個異構(gòu)體雜質(zhì)的母離子及各碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)Table 1 Accurate masses of parent ion and each fragment ions of mitiglinide and its three isomer impurities

2 結(jié)果與討論

2.1 方法分離情況

將1.2節(jié)中系統(tǒng)適用性溶液按1.4節(jié)中條件進行測定,結(jié)果見圖2a。

圖 2 米格列奈(a)系統(tǒng)適用性溶液與(b)消旋體對照 溶液的提取離子流色譜圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of (a)mitiglinide system suitability solution and (b) mitiglinide racemic solution

從圖2a可以看出,在單離子監(jiān)測模式(SIM)下,米格列奈的[M+H]+(m/z=316.190 72)的提取離子流色譜圖(EIC)可得到4個不同的色譜峰。對4個色譜峰的質(zhì)譜圖進行比較,結(jié)果見表1,各峰的精確質(zhì)量數(shù)與米格列奈[M+H]+的精確質(zhì)量數(shù)316.190 72相比,偏差均在2×10-6以內(nèi),可斷定4個色譜峰為4個不同的同分異構(gòu)體,其中含量最高的2號峰為米格列奈主成分,其余3個峰為米格列奈異構(gòu)體雜質(zhì)。因此,建立的反相液相色譜方法可以實現(xiàn)米格列奈主成分與3種異構(gòu)體雜質(zhì)的分離。

將1.2節(jié)中消旋體對照溶液按1.4節(jié)中條件進行測定,結(jié)果見圖2b?？梢钥闯?消旋體在本次建立的液相色譜方法中未能實現(xiàn)分離,因此3種異構(gòu)體雜質(zhì)均排除了光學異構(gòu)體的可能性。

圖 3 米格列奈及其3個異構(gòu)體的二級質(zhì)譜圖Fig. 3 MS/MS spectra of mitiglinide and its three isomers a. mitiglinide; b. isomer impurity 1; c. isomer impurity 2; d. isomer impurity 3.

2.2 米格列奈及其異構(gòu)體雜質(zhì)的質(zhì)譜碎裂情況及裂解機理分析

米格列奈及其3個異構(gòu)體雜質(zhì)的二級質(zhì)譜圖見圖3。米格列奈及其3個異構(gòu)體雜質(zhì)的母離子及各碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)見表1。

由表1可見,米格列奈及其3個異構(gòu)體雜質(zhì)的母離子及質(zhì)荷比(m/z)超過120的各碎片離子的質(zhì)量數(shù)偏差均在2 10-6以內(nèi)?？梢娒赘窳心渭捌?個異構(gòu)體雜質(zhì)的碎片離子的質(zhì)荷比基本相同。但由圖3可見,m/z分別為145、173和190的碎片離子的相對豐度存在明顯差異。其中米格列奈的3個碎片離子相對豐度約為5∶6∶1,異構(gòu)體雜質(zhì)1的3個碎片離子相對豐度約為10∶5∶1,異構(gòu)體雜質(zhì)2和異構(gòu)體雜質(zhì)3的3個碎片離子相對豐度約為1.2∶1.3∶1。根據(jù)母離子的精確質(zhì)量數(shù)以及各子離子的精確質(zhì)量數(shù),推斷米格列奈的質(zhì)譜裂解機理(見圖4)。與文獻[22]對比,米格列奈異構(gòu)體1的色譜相對保留情況及各子離子豐度與米格列奈已知的一種位置異構(gòu)體基本一致,因此推測米格列奈異構(gòu)體1為米格列奈的位置異構(gòu)體,根據(jù)該已知結(jié)構(gòu)以及二級質(zhì)譜數(shù)據(jù),推斷米格列奈異構(gòu)體雜質(zhì)1的質(zhì)譜裂解機理(見圖4)。異構(gòu)體雜質(zhì)2和異構(gòu)體雜質(zhì)3之前未見文獻報道,且二者的一級質(zhì)譜圖及二級質(zhì)譜圖均無明顯差異,因此本研究中未能確認其結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜裂解機理。根據(jù)其m/z為190的碎片離子豐度明顯高于米格列奈主成分及異構(gòu)體雜質(zhì)1這一現(xiàn)象,推測其可能的結(jié)構(gòu)及裂解機理(見圖4)。

2.3 方法的檢出限、定量限、重復性和線性范圍

將1.2節(jié)中的標準工作溶液逐級稀釋,分別按1.4節(jié)中條件進行測定,以信噪比(S/N)大于3時的質(zhì)量濃度為檢出限,信噪比(S/N)大于10時的質(zhì)量濃度為定量限,最終測得檢出限為1 μg/L,定量限為2 μg/L。

將米格列奈質(zhì)量濃度為100 μg/L的標準工作溶液連續(xù)進樣6次,保留時間的相對標準偏差(RSD)為0.2%,峰面積的RSD為2.0%,可以滿足分析要求。

將1.2節(jié)中的系列標準工作溶液分別按1.4節(jié)中的條件進行測定,以質(zhì)量濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標,進行線性回歸,得到的線性回歸方程為:Y=5.03×105X+1.09×107,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 7,線性良好。然而對該線性擬合進行F檢驗,發(fā)現(xiàn)由于線性范圍超過4個數(shù)量級,不同數(shù)量級對線性的貢獻差異較大,導致低濃度存在失擬的情況,結(jié)果偏差較大。因此,采用分別將質(zhì)量濃度與峰面積取對數(shù)的方法進行線性回歸,得到的線性回歸方程為:Y=0.977 2X+5.787 3,相關(guān)系數(shù)r2為0.999 9,線性良好。該取對數(shù)線性擬合F檢驗結(jié)果良好,在各濃度條件下結(jié)果偏差均較小,因此后續(xù)定量實驗均采用取對數(shù)擬合線性方程進行計算。

2.4 異構(gòu)體雜質(zhì)來源的分析

將1.3節(jié)中的各破壞試驗溶液,分別按1.4節(jié)中條件進行測定,采用主成分自身對照法,用2.3節(jié)中取對數(shù)得到的線性回歸方程進行計算,從而得出3種異構(gòu)體雜質(zhì)的溶液濃度,以測定破壞試驗所得3種異構(gòu)體雜質(zhì)含量,結(jié)果見表2。

由表2可見,除異構(gòu)體雜質(zhì)1在加熱條件下含量明顯增加外,其他條件下均未有異構(gòu)體雜質(zhì)含量顯著變化的情況。說明異構(gòu)體雜質(zhì)1可由米格列奈加熱降解得到,而異構(gòu)體雜質(zhì)2與異構(gòu)體雜質(zhì)3則在各破壞試驗條件下穩(wěn)定,因此考慮其為合成工藝雜質(zhì)。此外,異構(gòu)體雜質(zhì)1的降解情況與文獻[22]中米格列奈已知位置異構(gòu)體的降解情況一致,結(jié)合2.2節(jié)內(nèi)容可基本確認異構(gòu)體雜質(zhì)1為米格列奈位置異構(gòu)體。

2.5 實際樣品的測定

將各企業(yè)提供的米格列奈鈣原料按1.2節(jié)配制成供試品溶液,并按1.4節(jié)中條件進行測定。采用主成分自身對照法,用2.3節(jié)中取對數(shù)得到的線性回歸方程進行計算,得到各企業(yè)提供的米格列奈鈣原料樣品中3種異構(gòu)體雜質(zhì)的含量(見表3)?？梢钥闯?各企業(yè)間異構(gòu)體雜質(zhì)1的含量存在明顯差異,個別企業(yè)可達到0.1%;而各企業(yè)異構(gòu)體雜質(zhì)2和異構(gòu)體雜質(zhì)3的含量相差不大,且含量較低,均低于0.01%。

表 2 各破壞試驗樣品中3種異構(gòu)體雜質(zhì)的含量Table 2 Percentages of the three isomer impurities in the samples of different degradation tests

表 3 各企業(yè)米格列奈鈣原料樣品中3種異構(gòu)體雜質(zhì)的含量Table 3 Percentages of the three isomer impurities in the samples of the mitiglinide calcium raw material

3 結(jié)論

本文建立了可以實現(xiàn)米格列奈及其3種異構(gòu)體分離的RPLC-MS方法,該方法線性良好,靈敏度高,可滿足分析需求。同時利用高分辨質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)及碎裂情況對米格列奈及其異構(gòu)體進行了分析,發(fā)現(xiàn)其碎片離子豐度存在明顯差異,從而確認異構(gòu)體雜質(zhì)2和異構(gòu)體雜質(zhì)3為首次發(fā)現(xiàn)的異構(gòu)體雜質(zhì),并對米格列奈及各異構(gòu)體雜質(zhì)可能的質(zhì)譜裂解機理進行了推斷。在此基礎(chǔ)上,對異構(gòu)體雜質(zhì)來源進行了分析,發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體雜質(zhì)1可在高溫下降解產(chǎn)生,而異構(gòu)體雜質(zhì)2和異構(gòu)體雜質(zhì)3在各破壞試驗中穩(wěn)定,因此考慮其為合成雜質(zhì)。對各企業(yè)原料進行測定,發(fā)現(xiàn)各企業(yè)異構(gòu)體雜質(zhì)含量存在一定差異。因此,在今后的工作中,對新發(fā)現(xiàn)的兩種合成產(chǎn)生的異構(gòu)體雜質(zhì)進行進一步研究,可能對各企業(yè)改善其米格列奈原料合成工藝提供新的思路和方向。