消炎寧糖漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李 霞，張子龍

(武漢市江夏區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430200)

消炎寧糖漿是武漢市江夏區(qū)中醫(yī)醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”)協(xié)定處方中藥制劑，有20多年的臨床使用歷史，制劑批準(zhǔn)文號(hào)為鄂藥制字Z20111769，其可清熱解毒、瀉火，用于治療口腔咽喉腫痛、牙痛、牙周炎及風(fēng)熱感冒初起。其由金銀花、白芷、牡丹皮、青皮及荊芥等十余味中藥組成，臨床療效顯著。但原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于簡(jiǎn)單，只有相對(duì)密度、pH和性狀的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。為了更好地為患者服務(wù)，保證該制劑質(zhì)量穩(wěn)定可控，本研究對(duì)該制劑主要藥材的定性鑒別及主要有效成分的含量等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了一系列的探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 儀器

SSievans Series 1500型高效液相色譜儀(美國(guó)SSI科學(xué)系統(tǒng)公司)；Rromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；HX-03型超聲波清洗器(武漢恒信世紀(jì)科技有限公司)；GoodSee-Ⅱ型暗箱式薄層色譜攝影儀(上?？普苌萍加邢薰?；pHS-25型數(shù)顯酸度計(jì)(杭州奧立龍儀器有限公司)；恒溫水浴箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)；10 cm×10 cm信誼P型單槽層析缸(上海信誼儀器廠有限公司)。

1.2 藥品與試劑

綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-200212，L-007-160504)；橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)：C-006-170216，110721-201115)；丹皮酚對(duì)照品(批號(hào)：110708-200506)；以上對(duì)照品均為供含量測(cè)定用，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。青皮、金銀花及牡丹皮對(duì)照藥材購(gòu)自湖北強(qiáng)康中藥飲片有限公司，經(jīng)我院中藥驗(yàn)收員鑒定為正品。層析用硅膠G(青島海洋化工廠分廠)，乙腈為色譜純，水為屈臣氏純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)，其他試劑均為分析純；消炎寧糖漿(批號(hào)：170904、171219、180122、180309、180316及180510)和陰性對(duì)照品均為我院生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 青皮的薄層色譜鑒別：(1)取樣品溶液40 ml，加乙酸乙酯30 ml，輕輕振搖，靜置，分取乙酸乙酯液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。(2)按處方比例和制法工藝制成缺青皮藥材的陰性提取液。同上法制成陰性對(duì)照溶液。(3)取青皮5 g，加水200 ml，煎煮約30 min后，放冷，取濾液40 ml，同法制成青皮藥材對(duì)照溶液。(4)取橙皮苷對(duì)照品加甲醇制成1 mg/m1的甲醇溶液，作為對(duì)照品溶液。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2015年版)“通則0502”薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一含1%NaOH的硅膠G上，以乙酸乙酯-甲醇-水(V∶V∶V=100∶17∶13)為展開(kāi)劑，展開(kāi)約8～9 cm，晾干，在365 nm紫外燈下檢視[1-2]。結(jié)果顯示,樣品色譜中有相應(yīng)對(duì)照品斑點(diǎn)，而缺青皮的陰性對(duì)照品色譜無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

1.陰性對(duì)照溶液；2.青皮藥材對(duì)照溶液；3—4.供試品溶液；5.對(duì)照品溶液1. negative control solution; 2. contrast solution of pericarpium citri reticulatae viride; 3-4. test solution; 5. reference solution圖1 青皮的薄層色譜圖Fig 1 Thin layer chromatography of pericarpium citri reticulatae viride

2.1.2 金銀花的薄層色譜鑒別：(1)取樣品溶液40 ml，用稀鹽酸調(diào)pH(3～4)，加乙酸乙酯30 ml，輕搖提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，即得供試品溶液。(2)按處方比例和制法工藝制成缺金銀花藥材的陰性提取液。再同上法制成陰性對(duì)照品溶液。(3)取金銀花藥材5 g，加水200 ml，煎煮約30 min后，放冷，取濾液40 ml，同法制成金銀花藥材對(duì)照溶液。(4)精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成含量為1 mg/m1的對(duì)照品溶液。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2015年版)“通則0502”薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(V∶V∶V=14∶5∶5)靜置12 h以上的上層液為展開(kāi)劑，展開(kāi)約8～9 cm，取出，晾干[2-3]。在365 nm紫外燈下檢視，結(jié)果顯示，樣品色譜中有相應(yīng)對(duì)照品斑點(diǎn)，而缺金銀花的陰性對(duì)照品色譜無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

1.陰性對(duì)照溶液；2.金銀花藥材對(duì)照溶液；3—4.供試品溶液；5.對(duì)照品溶液1.negative control solution; 2.contrast solution of honeysuckle; 3-4.test solution; 5.reference solution圖2 金銀花的薄層色譜圖Fig 2 Thin layer chromatography of honeysuckle

2.1.3 牡丹皮的薄層色譜鑒別：(1)取本品50 m1，置于分液漏斗中，加水25 m1，搖勻，加乙醚30 m1，輕輕滾動(dòng)振搖提取，靜置，萃取乙醚液，揮干，加丙酮1 m1使溶解，作為供試品溶液。(2)按消炎寧處方比例及制備工藝，制備缺牡丹皮的陰性對(duì)照樣品，再同上法制備缺丹皮的陰性對(duì)照溶液。(3)取牡丹皮藥材5 g，加水200 ml，煎煮約30 min后，放冷，取濾液40 ml，同法制成牡丹皮藥材對(duì)照溶液。(4)精密稱(chēng)取丹皮酚對(duì)照品，加丙酮制成丹皮酚含量為1 mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2015年版)“通則0502”薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述丹皮酚對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(V∶V=3∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)約8～9 cm，取出晾干，噴以1%三氯化鐵試液，立即檢視[2，4]。結(jié)果顯示，樣品色譜中有相應(yīng)對(duì)照品斑點(diǎn)，而缺牡丹皮的陰性對(duì)照色譜無(wú)相應(yīng)斑點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

1.陰性對(duì)照溶液；2—3.供試品溶液；4.牡丹皮藥材對(duì)照溶液；5.對(duì)照品溶液1. negative control solution; 2-3. test solution；4. contrast solution of moutan bark；5. reference solution圖3 丹皮酚的薄層色譜圖Fig 3 Thin layer chromatography of moutan bark

2.2 高效液相色譜法測(cè)定消炎寧糖漿中綠原酸的含量

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品5.3 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取上述溶液1 ml，置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備：取本品5 ml，置于25 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，靜置，吸取上清液過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備：按處方比例及工藝制備不含金銀花的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 色譜條件及專(zhuān)屬性考察：采用SSievans Series 1500高效液相色譜儀，色譜柱為Rromasil C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(V∶V=13∶87)，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，柱溫為26 ℃，流速為1.0 ml/min[5-10]。取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，分別進(jìn)樣20 μl，高效液相色譜圖見(jiàn)圖4?？梢?jiàn)，綠原酸色譜峰的tR為12 min左右，無(wú)金銀花的陰性對(duì)照溶液在此范圍無(wú)色譜吸收峰，可以認(rèn)為在本研究所制定的含量測(cè)定條件下，除金銀花外的其他組分對(duì)本制劑中綠原酸含量的測(cè)定無(wú)干擾，即所選擇的分析方法專(zhuān)屬性良好。

A. 對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液A. control solution；B. test solution；C. negative control solution圖4 高效液相色譜圖Fig 4 High performance liquid chromatography

2.2.5 線性關(guān)系考察：精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品5.30 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，溶解，搖勻，再吸取上述溶液2 ml，置于20 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為53 μg/ml的溶液；精密吸取該溶液1、2和4 ml，分別置于10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為5.3、10.6和21.2 μg/ml的溶液；再精密吸取質(zhì)量濃度5.3 μg/ml的溶液2、4 ml，分別置于10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為1.06、2.12 μg/ml的溶液。按“2.2.4”項(xiàng)下條件每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣20 μl。以進(jìn)樣濃度為縱坐標(biāo)(Y)，以峰面積為橫坐標(biāo)(X)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11-15]。結(jié)果表明，綠原酸進(jìn)樣質(zhì)量濃度在1.06～53.00 μg/ml之間時(shí)，與峰面積值呈良好的線性關(guān)系，R2=0.999 4，見(jiàn)圖5。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 5 Standard curve

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品(批號(hào)：180122)共6份各2 ml，分別置于10 ml容量瓶中，制備供試品溶液，測(cè)定消炎寧糖漿中綠原酸的含量。結(jié)果其RSD為1.79%，表明重復(fù)性良好，見(jiàn)表1。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取放置0、2、4、8、12及24 h的供試品溶液(批號(hào)：180316)，測(cè)定綠原酸的峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸峰面積的RSD為1.09%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定，見(jiàn)表2。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)：精密量取已知綠原酸含量的樣品6份(每份1 ml)，分別添加綠原酸對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度530.0 μg/ml)0.2、0.4及0.6 ml，每個(gè)梯度平行2份，加甲醇至10 ml，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，入液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)考察結(jié)果Tab 1 Inspection results of repeatability test

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)考察結(jié)果Tab 2 Inspection results of stability test

表3 綠原酸的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of sample recovery test of chlorogenic acid

2.2.9 樣品含量測(cè)定和含量限度的制定：取批號(hào)分別為170904、171219、180122、180309、180316及180510的樣品6批，制備供試品溶液，測(cè)定綠原酸的含量。結(jié)果表明，6批樣品中綠原酸平均含量為0.43 mg/ml，最低含量為0.36 mg/ml，考慮到中藥材來(lái)源、加工及貯存等多種原因的影響，擬定每1 ml樣品中綠原酸的含量不得低于0.30 mg，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 消炎寧糖漿中綠原酸的含量測(cè)定結(jié)果Tab 4 Results of content determination of chlorogenic acid in Xiaoyanning syrup

3 討論

消炎寧糖漿中含十余味中藥材，有辛涼解表、清熱瀉火解毒的功效。其中，牡丹皮清熱涼血，消炎鎮(zhèn)痛，活血化瘀，有抗炎抑菌的藥理作用；青皮疏肝破氣，散結(jié)消痰，上述二者分別為方中臣藥和佐使藥，指標(biāo)性成分為丹皮酚和橙皮苷。金銀花是方中君藥，為治療風(fēng)熱感冒初起要藥，所含的綠原酸是金銀花抗菌、抗病毒的主要有效藥理成分之一。為了較好地反映消炎寧糖漿的內(nèi)在質(zhì)量，選擇金銀花、丹皮及青皮進(jìn)行定性鑒別并測(cè)定綠原酸含量。本制劑薄層色譜鑒定的供試品均采用了有機(jī)溶劑萃取，結(jié)果顯示，斑點(diǎn)清晰無(wú)干擾，重復(fù)性好。參考相關(guān)文獻(xiàn),進(jìn)行綠原酸含量測(cè)定，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，確定色譜條件，即流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(V∶V=13∶87)，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，柱溫為26 ℃，流速為1.0 ml/min最為適宜。