鄱陽湖區(qū)某農(nóng)田土壤中多環(huán)芳烴降解菌物種多樣性調(diào)查

金衛(wèi)根 王雅

摘要：從鄱陽湖區(qū)南昌縣某湖畔稻田、湖畔萊地、岸堤萊地和堤內(nèi)稻田分別采集土樣，用濃度大于95%的PAHs試劑菲、蒽和苯并菲等為唯一碳源設(shè)置培養(yǎng)基，從土樣中篩選PAHs降解菌。經(jīng)培養(yǎng)和分離純化，共篩選到菌株23種，其中細(xì)菌17種，真菌6種，對(duì)所篩選到的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和分析。

關(guān)鍵詞：鄱陽湖區(qū);農(nóng)田土壤;多環(huán)芳烴降解菌;物種多樣性

多環(huán)芳烴（PAHs）廣泛存在于土壤環(huán)境中，在自然條件下難于降解，對(duì)人類健康和生態(tài)安全構(gòu)成了極大危害[1-2]，近年來，對(duì)土壤PAHs的研究報(bào)道呈持續(xù)增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)[3]。鄱陽湖區(qū)是江西省農(nóng)產(chǎn)品主產(chǎn)區(qū)，特別是自2009年底國(guó)務(wù)院正式批復(fù)《鄱陽湖生態(tài)經(jīng)濟(jì)區(qū)規(guī)劃》以來，鄱陽湖區(qū)已經(jīng)成為江西省生態(tài)文明先行示范區(qū)開發(fā)與建設(shè)的主戰(zhàn)場(chǎng)。因而治理鄱陽湖區(qū)農(nóng)田土壤中的PAHs污染，是迫在眉睫的任務(wù)。

筆者分別從鄱陽湖區(qū)南昌縣某湖畔稻田、湖畔菜地、岸堤菜地和堤內(nèi)稻田采集土樣，用濃度大于95%的PAHs試劑菲、蒽和苯并菲作為唯一碳源設(shè)置培養(yǎng)基[4]，從土樣中篩選出能夠降解PAHs的降解菌，對(duì)降解菌的物種多樣性進(jìn)行形態(tài)觀察和分析，為下一步開展鄱陽湖區(qū)農(nóng)田土壤PAHs污染的微生物修復(fù)提供優(yōu)良菌種。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 土樣

土壤樣品分別采挖于鄱陽湖區(qū)南昌縣4個(gè)不同的農(nóng)田生境（見表1），通過棋盤式布點(diǎn)采樣，采集表層土壤（0-20cm），新鮮土樣裝于保鮮袋中，置于4℃冰箱保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基：K₂HPO₄6g/L、KH₂PO₄2g/L、NH₄NO₃、1g/L、NaCI 3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、FeSO₄0.02g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.0039/L、MnCI2·4H₂O 0.0039/L、CoCl₂·6H₂O 0.001g/L、CUSO₄·5H₂O 0.001g/L、H₂O1000mL、pH值7.0～7.2，用高壓蒸氣滅菌鍋在121℃條件下滅菌25min后備用。

1.2.2 PAHs降解菌篩選液體培養(yǎng)基：在無菌操作條件下，分別在滅好菌的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入PAHs試劑菲、蕙或苯并菲。

1.2.3 PAHs選擇性固體培養(yǎng)基：把瓊脂加入到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中成為固體支持物，再放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在121℃條件下滅菌。之后進(jìn)一步在該固體培養(yǎng)基上均勻涂布PAHs-丙酮溶液，至丙酮完全揮發(fā)后備用[5]。

1.3 PAHs試劑

試劑菲（Phenanthrene）的純度為95%，試劑蒽（An-thracene）的純度為97%、均購(gòu)自上海晶純?cè)噭┯邢薰?，苯并菲（Triphenylene）純度為97%、購(gòu)自Alfa Aesar，johnson matthey公司。

1.4 土壤PAHs降解菌的篩選

篩選前準(zhǔn)備好試管、三角瓶、涂菌棒、吸管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)等，并經(jīng)嚴(yán)格消毒后備用。

制備土壤樣品的稀釋液，在無菌條件下操作。首先把含有PAHs試劑菲、蕙和苯并菲（濃度均為50mg/L）的無機(jī)鹽培養(yǎng)基裝入250mL的三角瓶中，再分別向三角瓶?jī)?nèi)加入1g土樣（上述4個(gè)不同的農(nóng)田生境土樣分4批操作），滅菌玻璃珠25粒左右，在25℃時(shí)以120r/min水浴搖床避光培養(yǎng)5d，之后取上清液10mL，進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到新配置的選擇性無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，又經(jīng)上述同樣的條件，連續(xù)進(jìn)行富集培養(yǎng)5次，直到培養(yǎng)基中出現(xiàn)明顯的渾濁為止。然后吸取0.5mL的降解菌培養(yǎng)液，在稀釋10倍后，再在含有PAHs試劑的選擇性固體培養(yǎng)基上用平板劃線法反復(fù)劃線多次，經(jīng)培養(yǎng)3-5d后可以分離純化出同一形態(tài)的單一菌種[6]，用于進(jìn)行菌體形態(tài)觀察和分析。

2 土壤PAHs降解菌篩選結(jié)果

對(duì)本實(shí)驗(yàn)的篩選結(jié)果進(jìn)行形態(tài)觀察和分析，區(qū)分細(xì)菌和真菌，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)共篩選到菌株23種，其中細(xì)菌17種，真菌6種，每種菌株的形態(tài)特征見表2。

3 結(jié)果分析

（1）普遍認(rèn)為，在農(nóng)田土壤中存在一定種類和數(shù)量的 PAHs土著降解菌[7]。由于鄱陽湖區(qū)農(nóng)田生境多樣，不同的農(nóng)田生境對(duì)PAHs降解菌的選擇性不同，必能表現(xiàn)出PAHs降解菌的多樣性，本結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。

（2）在農(nóng)田土壤中，不僅細(xì)菌多樣性豐富，真菌也有很高的多樣性，但本實(shí)驗(yàn)中篩選到的真菌種類較少，可能是由于真菌在分離培養(yǎng)時(shí)難以PAHs為唯一碳源生長(zhǎng)的原因[8]。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，同樣的培養(yǎng)條件，細(xì)菌較之真菌，在培養(yǎng)初期生長(zhǎng)、分裂的速度較慢。

（3）本實(shí)驗(yàn)成功篩選到PAHs降解菌23種，但由于菌源對(duì)多環(huán)芳烴降解菌的篩選有明顯影響[9]，本實(shí)驗(yàn)所篩選的PAHs降解菌在多樣性方面仍有一定的局限性，下一步將擴(kuò)大采樣范圍，以期篩選到更多的PAHs降解菌，為進(jìn)一步馴化高效降解菌提供菌種資源。

4 結(jié)語

由于PAHs廣泛分布于土壤環(huán)境中，任何有機(jī)物的燃燒、加工使用，或廢棄的地方都有可能產(chǎn)生PAHs。土壤中的PAHs，極少量可能來源于植物和土壤中的細(xì)菌合成，絕大部分則來源于人們?nèi)粘５墓まr(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活活動(dòng)[10]。石化化工產(chǎn)業(yè)過程中的石油泄漏或煉油過程;工業(yè)生產(chǎn)中的燃煤;交通運(yùn)輸中的汽車尾氣排放或輪胎摩擦;日常生活中燃燒煤炭、使用天然氣、或者有機(jī)固體廢物的傾倒等，都會(huì)產(chǎn)生大量的PAHs[11]。正因?yàn)槿绱耍蛾柡^(qū)作為江西省生態(tài)文明建設(shè)先行示范區(qū)，其PAHs污染的修復(fù)顯得十分迫切和繁重，而微生物修復(fù)作為生態(tài)效益最高的一種手段，應(yīng)是下一步重點(diǎn)發(fā)展的方向，本實(shí)驗(yàn)將為鄱陽湖區(qū)農(nóng)田土壤PAHs污染的微生物修復(fù)提供菌種資源和科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳春云，岳珂，陳振明，等.微生物降解多環(huán)芳烴的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2007，27（6）：100-103

[2]Gondek K，Kopec M，Chmiel M，Spaek I.Response of Zea Maize andMicroorganisms to Soil Pollution with Polycyclic Aromatic Hydrocar-bons（PAHs）.Polish J.of Environ.Stud，2008，17（6）：875-880

[3]吳健，王敏，靳志輝，等.土壤環(huán)境中多環(huán)芳烴研究的回顧與展望[J].土壤學(xué)報(bào)，2016，53（5）：1085-1096

[4]唐婷婷，金衛(wèi)根.多環(huán)芳烴生物降解機(jī)理研究進(jìn)展[J].土壤，2010，42（6）：876-881

[5]金衛(wèi)根，陳傳紅，周亞平，等.兩株多環(huán)芳烴降解菌對(duì)菲、蒽、笨并菲的降解效果[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（3）：73-76

[6]金衛(wèi)根，陳傳紅，周亞平，等.兩株多環(huán)芳烴降解菌的篩選與生化鑒定[J].農(nóng)業(yè)科技與信息，2015（17）：86-89

[7]劉魏魏，尹睿，林先貴，等.多環(huán)芳烴污染土壤的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)初探[J].土壤，2010，42（5）：800-806

[8]吳宇澄，林先貴.多環(huán)芳烴污染土壤真菌修復(fù)進(jìn)展[J].土壤學(xué)報(bào)，2013，50（6）：1191-1199

[9]伍鳳姬，張夢(mèng)露，郭楚玲，等.菌源對(duì)多環(huán)芳烴降解菌的篩選及降解性能的影響[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2014，8（8）：3511-3518

[10]Kordybach BM，Smreczak B，Pawlas AK.Concentrations，sources，and spatial distribution of individual polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）in agricultural soils in the Eastern part of the EU：Poland as a casestudy.Sci Total Environ，2009，407（12）：3746-3753.

[11]Manilal VB.，Alexander M.Factors affecting the microbial degrada-tion of phenanthrene in soil.Appl Microbiol and Biotechnol，1991，35（3）：401-405