硼促進(jìn)缺鐵條件下擬南芥根系細(xì)胞壁鐵的再利用

吳 啟，朱曉芳，沈仁芳*

（1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室/中國科學(xué)院南京土壤研究所，南京 210008；2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

鐵在地殼中含量十分豐富，約占地殼總重量的5%左右。同時鐵也是動植物生長發(fā)育所必需的微量元素，作為許多功能蛋白的重要組成部分，鐵能參與高等植物的光合作用和氮同化等生理生化過程[1-2]。雖然在土壤中鐵的含量很高，但其主要是以Fe3+復(fù)合物的形式存在，而植物可以直接吸收利用的Fe2+含量卻是很低的。尤其是在堿性和石灰性土壤中，由于高pH和強(qiáng)氧化作用使得土壤中的Fe3+溶解度極低，從而抑制了土壤中游離鐵的有效性，最終限制植物的生長發(fā)育[3-4]。據(jù)統(tǒng)計，全世界約有30%的土壤處于鐵饑餓狀態(tài)[5]，地中海地區(qū)、北美大陸、南美的部分地區(qū)都嚴(yán)重缺鐵。而我國西南地區(qū)、淮北平原以及西北等地均有缺鐵現(xiàn)象的發(fā)生[6]。缺鐵導(dǎo)致的癥狀首先是新葉出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，鐵元素由地下部向上運輸?shù)倪^程受阻，從而造成營養(yǎng)元素的分配不均勻，最終導(dǎo)致作物營養(yǎng)不良，品質(zhì)和產(chǎn)量嚴(yán)重受限，進(jìn)而影響人類的飲食健康[7]。

高等植物在漫長的進(jìn)化過程中逐漸形成了一整套完善而復(fù)雜的應(yīng)答缺鐵的策略。根據(jù)植物對缺鐵表現(xiàn)的形態(tài)學(xué)差異和生理變化的不同，人為地將這些植物劃分為非禾本科植物和雙子葉植物所共有的機(jī)理Ⅰ和禾本科所特有的機(jī)理Ⅱ。在受到缺鐵脅迫時，機(jī)理Ⅰ植物主要有以下三個步驟響應(yīng)缺鐵信號：首先，植物根系表面的ATP酶 (H+-ATPase) 會首先活化，向根系外分泌H+來酸化土壤，增加Fe3+的溶解度來促進(jìn)植物對鐵的吸收[8]。如擬南芥中的AHA(Arabidopsis H+-ATPase isoform) 家族基因就是在該過程起著重要的作用[9]。其次，根系表面溶解的Fe3+需要轉(zhuǎn)化成Fe2+形式才能被植物所吸收，位于根系細(xì)胞膜表面的鐵離子螯合還原酶 (ferric-chelate reductase oxidase, FRO) 可以將根表面的三價鐵還原成二價鐵以供植物吸收利用[10]。最后，還原后的Fe2+會在一系列鐵轉(zhuǎn)運蛋白 (iron-regulated transport, IRT)的運輸下轉(zhuǎn)運到根皮層細(xì)胞[11]，之后再進(jìn)一步通過各類轉(zhuǎn)運蛋白運輸?shù)郊?xì)胞的各個組織器官供植物體吸收。機(jī)理Ⅱ植物包括水稻、玉米、小麥和大麥等多種農(nóng)作物。研究發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)苛的缺鐵條件下，禾本科植物往往能比雙子葉或非禾本科植物表現(xiàn)出更高的抗性[12]，其主要原因是這些植物在受到缺鐵信號脅迫時往往能夠分泌麥根酸類 (mugineic acid, MA) 物質(zhì)[13]，這類物質(zhì)能夠與根系微環(huán)境中的Fe3+螯合形成Fe3+-PS復(fù)合體，最終被根表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上的YS/YSL (yellow stripe/yellow stripe like) 家族轉(zhuǎn)運蛋白吸收[14]。

作為植物接觸和響應(yīng)外界信號的第一道屏障，細(xì)胞壁在植物抵御鋁毒和鎘毒的過程中發(fā)揮了重要的作用[15-16]。Chang等[17]研究表明，在鋁毒脅迫下，植物細(xì)胞中的鋁主要集中在細(xì)胞壁的果膠中。為了進(jìn)一步明確果膠在植物耐鋁中所發(fā)揮的作用，Zheng等[18]利用果膠酶可以降解果膠的原理，發(fā)現(xiàn)去除細(xì)胞壁果膠后，細(xì)胞壁可結(jié)合的Al含量減少了約50%，說明細(xì)胞壁果膠成分在結(jié)合Al方面確實起著重要的作用。而對于細(xì)胞壁緩解鎘毒的相關(guān)研究，Zhu等[16,19]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁組分中的半纖維素可以結(jié)合鎘，外源添加生長素可增強(qiáng)半纖維素對鎘的結(jié)合能力，減少鎘由地下部向上運輸?shù)倪^程，從而緩解植物鎘毒的危害。除了可以緩解鎘毒和鋁毒，最近的研究表明，細(xì)胞壁還參與植物抵抗缺鐵逆境的過程[20]。Zhu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，NaCl可以通過激發(fā)根系細(xì)胞壁鐵的再利用和再分配機(jī)制來緩解擬南芥的缺鐵癥狀，進(jìn)一步研究顯示，脫落酸作為一類植物逆境激素，可以通過參與調(diào)解細(xì)胞壁組分的合成來響應(yīng)植物缺鐵的信號。

硼也是植物生長發(fā)育所必需的微量元素，在植物中主要以硼-糖復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞壁中[22]，可以用來維持植物細(xì)胞壁的穩(wěn)定性[23]。同時，硼還能夠參與碳水化合物的運輸、花粉萌發(fā)和花粉管生長等一系列生理生化過程，對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)都有極其重要的影響[24]。一般認(rèn)為，細(xì)胞中 80%以上的硼可以和細(xì)胞壁的果膠成分相結(jié)合，形成大小合適的細(xì)胞壁孔徑，從而調(diào)節(jié)其他養(yǎng)分的吸收和轉(zhuǎn)運[25]。最近研究發(fā)現(xiàn)，硼可以通過膠聯(lián)細(xì)胞壁果膠成分來緩解植物體內(nèi)的鋁毒[26-27]，硼還可以和鈣協(xié)同作用緩解植物鋁毒的癥狀[28]，鋅硼之間的交互作用對植物生長、光合作用和水分的吸收都起著至關(guān)重要的作用[29]。但是，外源添加硼是否能夠緩解植物的缺鐵癥狀還鮮有研究，本試驗以模式作物擬南芥為研究材料，試圖揭示在缺鐵的條件下，微量元素硼能否可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁組分來提高植株體內(nèi)有效鐵的含量，從而達(dá)到緩解植物缺鐵的目的。

1 材料與方法

1.1 植物材料和培養(yǎng)條件

供試材料為野生型擬南芥Col-0 (Columbia ecotype)。挑選無病蟲害的擬南芥種子，首先用75%乙醇處理 5 min，對種子表面進(jìn)行消毒，再用無菌水清洗3次；然后將用全營養(yǎng)液浸泡過的海綿塞入1.5 mL去底eppendorf離心管中；再將消毒完畢的種子用牙簽點在濕潤的海綿上，隨后放入光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)室內(nèi)植物生長的條件：溫度為24°C，光照 16 h，黑夜 8 h，光照強(qiáng)度為 140 μmol/(m2·s)。

全營養(yǎng)液成分：大量元素濃度 (mmol/L) 為KNO36.0、Ca (NO3)24.0、MgSO41.0、NH4H2PO40.1；微量元素濃度 (μmol/L) 為 Fe (III) -EDTA 50、H3BO312.5、MnSO41.0、CuSO40.5、ZnSO41.0、H2MoO40.1、NiSO40.1。用1 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為 5.6。

在光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，將幼苗移至全營養(yǎng)液(pH 5.6) 生長2周。最后挑選長勢一致的擬南芥移入1.25 L用黑色塑料袋包裹的罐子里，每個罐子種 9 棵苗。對以上樣品進(jìn)行如下處理：+Fe (pH 5.6的全營養(yǎng)液)；+Fe + 100 μmol/L H3BO3；+Fe + 1000 μmol/L H3BO3；-Fe (pH 5.6不含鐵的營養(yǎng)液)；-Fe + 100 μmol/L H3BO3；-Fe + 1000 μmol/L H3BO3。處理中每隔3 d換一次營養(yǎng)液，處理共進(jìn)行了7 d。

1.2 葉綠素含量的測定

利用便攜式葉綠素儀 (Konica Minolta SPAD-502,Tokyo, Japan) 測定表征植株新葉葉綠素含量的SPAD值。

1.3 總鐵含量的測定

切除處理后擬南芥的根系和地上部，用蒸餾水清洗3次，在70°C烘箱中放置2 d后，分別稱重，記錄干重。再把樣品放入20 mL用酸浸泡過的消煮管中，加入2 mL HNO3/HClO4 (4∶1, v/v)，然后將消煮管放在消煮爐中130°C加熱，直至樣品澄清透亮，最后加入8 mL蒸餾水定容至10 mL，濾紙過濾后采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 (ICP-AES)測定溶液中的鐵含量[30]。

1.4 有效鐵含量的測定

參照Lei等的方法[31]，具體操作步驟如下：將處理后的植株根系和地上部分別用去離子水清洗后稱取鮮重，加入液氮后在研缽中充分研磨，最后加入8 mL去離子水充分浸提。24 h后對浸提液13200 rpm離心10 min，取上清液采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 (ICP-AES) 測定溶液中的鐵含量。

1.5 細(xì)胞壁成分的分級提取及細(xì)胞壁組分鐵的測定

細(xì)胞壁的提取：將擬南芥根系在去離子水下沖洗3遍后，用吸水紙吸干多余的水分。用鑷子將根系轉(zhuǎn)移到干凈的研缽中，加入過量的液氮充分研磨，然后加入8 mL 75%乙醇將研磨液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，放在漩渦震蕩儀上使之充分混勻，靜置20 min后5000 rpm離心10 min后倒掉上清液。然后依次加入丙酮、1∶1甲醇、氯仿的混合液以及甲醇，每次均在漩渦震蕩儀上震蕩數(shù)分鐘使提取液充分混勻， 然后靜置20 min后離心棄上清液。最后細(xì)胞壁粗提物放入冷凍干燥機(jī)干燥，4°C保存?zhèn)溆肹32]。

果膠的提取：稱取已經(jīng)提取好約2 mg的細(xì)胞壁放在1.5 mL離心管中，加入1 mL去離子水后在100°C沸水中水浴1 h，然后在12000 rpm下離心10 min，用移液槍吸取上清液至5 mL離心管中，再重復(fù)以上步驟2遍，最后用去離子水定容至3 mL即為所提果膠溶液[33]。

半纖維素的提?。涸谔崛」z后的殘渣中加入1 mL 24% KOH，室溫靜置12 h后，12000 rpm下離心 10 min，取上清液于5 mL離心管中，再重復(fù)一次上述步驟，將兩次所得的上清液合并在一起，用去離子水定容至2 mL即為半纖維素溶液。

細(xì)胞壁鐵含量的測定：稱取約2 mg的粗提細(xì)胞壁于1.5 mL離心管中，加入1 mL 2 mol/L HCl后放入搖床室溫震蕩3 d，然后利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 (ICP-AES) 測定細(xì)胞壁中的鐵含量。

細(xì)胞壁組分鐵含量的測定：分別取果膠和半纖維素溶液利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES) 測定其鐵含量。

1.6 半纖維素含量的測定

半纖維素含量一般用總糖的含量來表示。具體操作如下：取200 μL半纖維素于1.5 mL離心管中，隨后在離心管中加入10 μL 80%的苯酚和1 mL濃硫酸，室溫靜置15分鐘后再放入100°C沸水中水浴15分鐘，快速取出離心管置于冰上冷卻。然后在490 nm波長下比色。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照Dubios等方法[34]。

1.7 RNA提取和基因表達(dá)分析

擬南芥幼苗在+Fe + 100 μmol/L H3BO3、+Fe +1000 μmol/L H3BO3、-Fe+100 μmol/L H3BO3、-Fe +1000 μmol/L H3BO3溶液中處理7 d后，收集根系放入液氮中，隨后在研缽中加入液氮充分研磨，然后用植物RNA提取試劑盒 (TIANGEN) 并按照相關(guān)說明要求提取RNA，提取后的RNA用nanodrop檢測樣品濃度和質(zhì)量。先通過RNA濃度測定換算成含有1 μg的樣品，然后用PrimeScript RT試劑盒 (Takara)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA放入-20°C冰箱保存。

實時熒光定量PCR采用TAKARA公司生產(chǎn)的SYBR Premix ExTaq體系進(jìn)行 (Takara Bio，Inc，Japan)。首先將反轉(zhuǎn)得到的cDNA稀釋10倍用于定量PCR的模板。PCR循環(huán)體系為10 μL體系，其中1 μL 稀釋后的 cDNA，5 μLSYBR Premix ExTaq，0.5 μL的正向和反向引物，3 μL的無菌蒸餾水。PCR反應(yīng)的程序為： 95°C初預(yù)熱1 min，95°C變性15 s，55°C退火15 s，72°C延伸20 s，整個程序共45個循環(huán)。以tublin作為內(nèi)參基因，采用公式2－ΔΔCT計算不同處理間基因的相對表達(dá)量。上述試驗每個均有4個生物學(xué)重復(fù)和3個機(jī)械重復(fù)。

相關(guān)基因引物如下：

TUBLIN

上游引物 5’-AAGTTCTGGGAAGTGGTT-3’

下游引物 5’-CTCCCAATGAGTGACAAA-3’

FRD3

上游引物 5’-TTTTGTCGGGCGTTTAGG-3’

下游引物 5’-TTGCTGTGGCTGGTTGGT-3’

YSL2

上游引物5’-GGATACTTATTCTTCTCCCTT GTC-3’

下游引物 5’-CCATCGTTTTTTCCTGCC-3’

NAS1

上游引物5’-CATGATCTTCCACACAACGG AC-3’

下游引物 5’-CGACGTCATATTGGTCAA GGC-3’

1.8 一氧化氮 (NO) 含量的測定

利用3-氨基-4-甲氨基-2′-7′二氟熒光素測定擬南芥根系NO含量。具體操作如下，取根尖1 cm處在20 mmol/L的HEPE緩沖液中沖洗20 min，然后用鑷子將根尖剪出放在裝有10 μmol/L熒光染料的離心管中避光染色30 min，最后再用HEPE緩沖液沖洗根系3次，每次15 min。制片，在熒光顯微鏡下觀察，拍照，利用photoshop 軟件計算熒光度。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel2013、Sigmaplot13.0、Statistix8.0進(jìn)行分析整理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源硼對擬南芥缺鐵癥狀的緩解作用

為了探究外源添加硼在缺鐵脅迫中的作用，本試驗以模式植物擬南芥為材料，在正常和缺鐵的條件下采用不同濃度的硼處理后觀察植株表型并測定不同部位有效鐵含量。結(jié)果顯示，在正常全營養(yǎng)液條件下，添加外源硼不能改變植株的生長情況。當(dāng)受到缺鐵脅迫時，植株新葉首先出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，外源施加硼 (1000 μmol/L H3BO3) 可以顯著改善缺鐵癥狀 (圖1-A)；利用便攜式葉綠素儀測定植株新葉的葉綠素含量 (SPAD值)，結(jié)果表明，缺鐵情況下植株葉片的葉綠素含量隨著硼濃度的增加而顯著增加 (圖1-B)。值得關(guān)注的是，在缺鐵脅迫下，外源添加硼后可以顯著增加植株根系和地上部有效鐵的含量 (圖1-C、D)，表明硼緩解缺鐵癥狀的主要原因可能是植株體內(nèi)鐵的再利用機(jī)制。

2.2 外源硼對細(xì)胞壁鐵再利用的促進(jìn)作用

在缺鐵的條件下根系仍含有一定的有效鐵含量，筆者猜測可能與植株體內(nèi)鐵的再利用有關(guān)。因此為了探究其內(nèi)在的鐵再利用機(jī)制，筆者用不同濃度梯度的硼酸處理擬南芥幼苗7 d，分別測定了加鐵和不加鐵情況下根系細(xì)胞壁鐵的含量和其組分上結(jié)合的鐵含量。結(jié)果顯示，與單獨缺鐵環(huán)境相比，外源添加硼后細(xì)胞壁鐵和半纖維素鐵含量都顯著降低 (圖2-A、B)，且隨著硼酸濃度的增加，細(xì)胞壁組分結(jié)合的鐵含量降低。進(jìn)一步測定了細(xì)胞壁的半纖維素含量發(fā)現(xiàn)，隨著外源硼酸濃度的增加，細(xì)胞壁半纖維素含量也逐漸減少 (圖2-C)。綜上分析，推測硼可以通過提高細(xì)胞壁鐵含量釋放來增加植物體內(nèi)有效鐵的含量，從而確保植株在缺鐵的條件下正常生長。

圖1 不同濃度硼處理后葉片表型、葉綠素含量以及根系和地上部有效鐵含量Fig. 1 Phenotype and chlorophyll content of leaves, and soluble Fe contents in root and shoot after different concentrations of boron treatments

2.3 外源硼對植株體內(nèi)鐵由根系向地上部轉(zhuǎn)運的促進(jìn)作用

外源添加硼可以通過增加地上部有效鐵的含量從而緩解植株的缺鐵癥狀，為了進(jìn)一步探討其內(nèi)在的生理機(jī)制，測定了植株根系和地上部的總鐵含量。試驗結(jié)果顯示，在鐵含量充足的條件下，硼不影響根系和地上部總鐵含量的積累；但是在缺鐵的條件下，與不施加硼相比，外源施加硼酸，尤其是施加 1000 μmol/L H3BO3，根系和地上部單位質(zhì)量的總鐵含量都得到顯著增加 (圖3-A、B)。由圖3-C可以得出外源添加硼可以參與擬南芥體內(nèi)的鐵由根系向地上部轉(zhuǎn)運的過程。

圖2 不同處理擬南芥細(xì)胞壁鐵含量及半纖維素和半纖維素鐵含量Fig. 2 Iron contents in cell wall, hemicellulose and hemicellulose content after different boron treatments

圖3 不同濃度硼處理后根系和地上部鐵含量Fig. 3 Total iron content in root and shoot after different concentrations of boron treatments

2.4 擬南芥體內(nèi)鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達(dá)的變化

前面的結(jié)果表明，外源添加硼后可以促進(jìn)根系鐵向地上部的轉(zhuǎn)運，因此本試驗主要測定了外源添加硼前后這 3 個轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，鐵充足的情況下外源硼對這 3 個基因的影響不大。在缺鐵處理 7 d后，AtFRD3和AtNAS1基因表達(dá)顯著上調(diào)，卻抑制AtYSL2的表達(dá) (圖4-A、B、C)；然而再添加外源硼，特別是 1000 μmol/L硼酸后，這3 個基因的表達(dá)量顯著高于單純的缺鐵條件 (圖4)，暗示硼可能主要是通過調(diào)節(jié)AtFRD3、AtNAS1以及AtYSL2基因的表達(dá)來增加其有效鐵從根部向地上轉(zhuǎn)運的過程。

2.5 擬南芥根系一氧化氮 (NO) 含量的變化及其作用

為了明確一氧化氮 (NO) 和硼對缺鐵信號的影響，我們首先研究了缺鐵脅迫下外源加入硼后對內(nèi)源NO代謝的影響。結(jié)果顯示，在加鐵條件下，外源施加硼對根系NO含量沒有顯著影響 (圖5-A、B)，但是在缺鐵情況下，外源施加硼后根系NO含量是不施加硼情況的 1.5 倍 (圖5-C、D)，暗示信號分子NO可能參與了調(diào)控細(xì)胞壁鐵的再釋放過程。為了進(jìn)一步確定NO的作用，我們又對以上4個處理分別外源添加NO清除劑c-PTIO，結(jié)果顯示在加入c-PTIO后，以上4個處理根系NO含量皆顯著降低，且加入c-PTIO后上述 4 個處理的NO含量均處于同一水平上，說明c-PTIO對擬南芥根系NO的清除作用十分明顯 (圖5-E、F、G、H)。探究缺鐵條件下在營養(yǎng)液中加入NO清除劑c-PTIO后，外源添加硼緩解擬南芥缺鐵的癥狀可以被逆轉(zhuǎn)，這進(jìn)一步說明硼緩解缺鐵的癥狀是由信號分子NO所介導(dǎo)的(表1)。

圖4 不同濃度硼處理后鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)基因相對表達(dá)量Fig. 4 The relative expression of iron transporter after different boron treatments

圖5 不同濃度硼處理后對根系NO含量的影響Fig. 5 Effect of different boron treatments on NO production in root

3 討論

近年來，微量元素硼在植物逆境中發(fā)揮的重要作用也越來越受到人們的重視，比如可以在豌豆(Pisum sativum) 中抵御鋁毒。研究表明，硼可以促進(jìn)鋁在細(xì)胞壁果膠中的累積，并且通過抑制鋁的解吸作用來降低鋁在細(xì)胞中的可移動性。進(jìn)一步結(jié)果顯示，硼還可以通過降低果膠的甲酯化程度來增加細(xì)胞表層的負(fù)電荷，最終達(dá)到固定Al3+的作用[27]。不僅如此，硼還在植物鹽害中起關(guān)鍵的作用，Bastias等[35-36]發(fā)現(xiàn)硼可以通過維持細(xì)胞壁的延展性來調(diào)節(jié)植物葉片的水勢和滲透壓力，遺傳學(xué)證據(jù)顯示，水孔通道蛋白也能夠參與這種硼緩解鹽害的過程。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，隨著外源添加1000 μmol/L H3BO3時，在缺鐵的條件下，擬南芥根系和地上部的有效鐵含量都能夠顯著提高 (圖1)。很明顯在營養(yǎng)液缺鐵的情況下，仍然能夠檢測到植物根系含有可溶性鐵。根據(jù)前人的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁，尤其是細(xì)胞壁的組分半纖維素，是擬南芥根系鐵的重要結(jié)合位點。因此我們猜測在缺鐵的條件下，硼增加擬南芥體內(nèi)有效鐵的含量是由于細(xì)胞壁鐵的再利用機(jī)制導(dǎo)致的。

同時，一氧化氮 (NO) 是植物體內(nèi)重要的信號分子，它在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育以及幫助植物抵御逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用。本試驗中發(fā)現(xiàn)，外源添加硼酸可以促進(jìn)擬南芥根系細(xì)胞壁鐵的釋放來增加體內(nèi)的有效鐵含量，那么硼又是通過什么信號途徑介導(dǎo)缺鐵反應(yīng)的？因為之前的相關(guān)鐵含量和基因表達(dá)量數(shù)據(jù)均顯示1000 μmol/L H3BO3可以顯著緩解缺鐵癥狀，因此本試驗選取了+Fe、+Fe + 1000 μmol/L H3BO3、-Fe、-Fe + 1000 μmol/L H3BO34 個處理分別測定其根系NO含量，檢測到缺鐵環(huán)境中加硼后也能促進(jìn)根系NO的釋放，暗示信號分子NO確實也能夠參與調(diào)控植物體內(nèi)鐵的再利用過程，而在加入NO清除劑c-PTIO后，外源添加硼緩解擬南芥缺鐵的癥狀可以被逆轉(zhuǎn) (表1)，這也就進(jìn)一步解釋了硼緩解缺鐵的癥狀是由信號分子NO所介導(dǎo)的。

表1 NO清除劑c-PTIO對缺鐵情況下根系和地上部鐵含量的影響Table 1 Effect of NO scavenger c-PTIO on iron contents in root and shoot

擬南芥根系細(xì)胞壁在提高植物體內(nèi)鐵的再利用方面起著十分重要的作用。Andersen等[37]發(fā)現(xiàn)，在藻類中細(xì)胞壁的不同結(jié)構(gòu)可以影響鐵在體內(nèi)的分布。進(jìn)一步研究顯示，細(xì)胞壁木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)可以影響水稻和擬南芥種子中鐵含量的累積，具體表現(xiàn)為將位于細(xì)胞壁纖維素表面的鐵結(jié)合肽和碳水化合物結(jié)合肽的融合多肽轉(zhuǎn)入擬南芥和水稻后可以明顯看到種子中鐵含量的積累和生物量的增加，對于提高糧食作物的產(chǎn)量和解決全世界范圍內(nèi)鐵缺乏的問題具有積極的指導(dǎo)意義[38]。Zhu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，NaCl可以緩解擬南芥的缺鐵癥狀，其主要原因是缺鐵時外源添加NaCl后細(xì)胞壁組分半纖維素含量發(fā)生變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞壁半纖維素上結(jié)合的鐵游離到組織中供植物吸收，最終達(dá)到緩解植物缺鐵的效果；其后續(xù)的研究還發(fā)現(xiàn)，植物激素脫落酸 (ABA)可以作為一種信號分子，參與植物體內(nèi)細(xì)胞壁鐵的再轉(zhuǎn)運機(jī)制。植物細(xì)胞壁的半纖維素主要是在高爾基體中合成，在擬南芥中半纖維素最主要的成分是木葡聚糖。傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為，半纖維素的主要成分不帶電或者帶有中性電荷，因此很難像細(xì)胞壁果膠等成分一樣結(jié)合金屬陽離子。但是由于果膠與半纖維素之間能以共價鍵相結(jié)合，所以半纖維素上的金屬陽離子結(jié)合位點有可能會被果膠中不同形式的多糖所占據(jù)[39]。最新的研究結(jié)果顯示，細(xì)胞壁的半纖維素可能通過與鋁離子形成某種形式的復(fù)合物來參與調(diào)控植物體內(nèi)鋁的吸收與釋放過程[33]。但是有關(guān)細(xì)胞壁半纖維素上鐵的結(jié)合位點的研究仍未有報道。本試驗中，在缺鐵條件下外源添加硼后，擬南芥根系細(xì)胞壁鐵的含量顯著降低，同時細(xì)胞壁組分半纖維素含量和半纖維素結(jié)合的鐵含量也相應(yīng)減少，因此筆者認(rèn)為外源添加硼可以通過改變細(xì)胞壁組分半纖維素的含量，解吸半纖維素上吸附的鐵來提高體內(nèi)的有效鐵含量。

擬南芥體內(nèi)的一系列轉(zhuǎn)運蛋白不僅負(fù)責(zé)根系對土壤中鐵的吸收，還和體內(nèi)鐵的長距離運輸密切相關(guān)。鐵在木質(zhì)部運輸主要以鐵—檸檬酸復(fù)合物的形式存在，前人已經(jīng)報道的AtFRD3家族蛋白可以參與這一過程，遺傳學(xué)證據(jù)分析，Atfrd3突變體在鐵充足情況下葉片黃化，地上部有效鐵含量顯著降低但是根系卻積累大量的鐵，過表達(dá)Atfrd3后能夠回補(bǔ)這種缺鐵癥狀，說明AtFRD3蛋白確實參與了鐵由根系向地上部運輸?shù)倪^程[40]。關(guān)于韌皮部運輸，AtNAS1和AtYSL2轉(zhuǎn)運蛋白被認(rèn)為是在鐵韌皮部運輸中起著重要作用。當(dāng)在擬南芥中敲除AtNAS1和AtYSL2后，地上部鐵含量大幅度下降，并且伴隨著幼葉出現(xiàn)脈間失綠的現(xiàn)象，暗示著AtNAS1和AtYSL2可以調(diào)控擬南芥體內(nèi)鐵的動態(tài)平衡過程[41-42]。在本次試驗中發(fā)現(xiàn)，在缺鐵的條件下外源添加硼后，尤其是添加1000 μmol/L H3BO3后，擬南芥根系中AtFRD3、AtNAS1和AtYSL2的基因表達(dá)量都顯著高于正常的缺鐵條件，說明硼可以通過調(diào)控以上3個基因的表達(dá)來促進(jìn)體內(nèi)的鐵從根系向地上部運輸?shù)倪^程。

4 結(jié)論

在缺鐵的條件下，外源添加硼可以通過改變擬南芥體內(nèi)細(xì)胞壁半纖維素含量來促進(jìn)細(xì)胞壁鐵的解吸，從而增加根系和地上部的有效鐵含量。通過相關(guān)基因表達(dá)量分析，調(diào)控鐵運輸過程的幾個關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白AtFRD3、AtNAS1和AtYSL2參與并能促進(jìn)鐵從根系向地上部轉(zhuǎn)運的過程，而信號分子NO能夠參與這一過程并最終緩解植物的缺鐵癥狀。