UPLC-PDA法同時測定半枝蓮-白花蛇舌草藥對中3種成分

賴昌威， 張 蜀，2?， 鄧 紅，2， 吳國衛(wèi)， 閔 杰， 阮沛樺

（1.廣東藥科大學(xué)，廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東廣州510000；2.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510000）

半枝蓮為唇形科黃芩屬多年生草本植物半枝蓮Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，有清熱解毒、化瘀利尿等功效；白花蛇舌草為茜草科耳草屬一年生草本植物白花蛇舌草Oldenlandia diffusa（Willd.）Roxb.的干燥全草，有清熱解毒、活血止痛等功效，兩者合用可發(fā)揮協(xié)同增效、配伍減毒之作用，臨床上常作為藥對用于治療癌癥，市場上將近20個中藥復(fù)方制劑同時含有兩者，如天芝草膠囊、抗癌平丸等［1］。黃酮類為半枝蓮、白花蛇舌草的共同活性成分，有抗腫瘤、消炎、抑菌、抗氧化等藥理活性，以抗腫瘤作用更突出［2-3］，故總黃酮含有量是該藥對質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，而且半枝蓮中的野黃芩苷、白花蛇舌草中的蘆丁藥理活性明確［4-5］、含有量較高［6-7］，也可作為質(zhì)量控制指標(biāo)成分。

目前，比色法廣泛應(yīng)用于中藥材與成方制劑中總黃酮含有量的測定［8］，半枝蓮-白花蛇舌草藥對提取液中其測定也沿用此法［9-12］，雖然它應(yīng)用便捷、成本低廉，但并非完全適用，尤其是成方制劑中成分復(fù)雜，黃酮類型不一，難以滿足相關(guān)專屬性要求，可能會出現(xiàn)黃酮類成分的假陰性與非黃酮類成分的假陽性現(xiàn)象［13-14］。本實驗建立UPLCPDA法同時測定半枝蓮-白花蛇舌草藥對中蘆丁、野黃芩苷、總黃酮含有量，以期為該藥對質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY超高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器 （美國Waters公司）；電子分析天平 （千分之一、十萬分之一，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；超聲波清洗儀 （上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 材料 半枝蓮購自廣州至信藥業(yè)股份有限公司，白花蛇舌草購自廣州清平中藥材市場，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱教授鑒定均為正品。蘆丁 （批號110842-201709，含有量97.5%）、野黃芩苷 （批號100416-201607，含有量91.7%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲酸為色譜純；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC?HSS T3 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm， 1.8 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.5%甲酸（B）， 梯度洗脫 （0～2 min， 10%A； 2～3 min， 10%→17%A；3～9 min， 17%A； 9～12 min， 17% →20%A； 12～20 min，20%→27%A； 20～25 min， 27%→42%A； 25～26 min， 42%→10%A）；體積流量0.3 mL／min；檢測波長354 nm （蘆?。?、333 nm （野黃芩苷）；柱溫30℃；進樣量1 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁、野黃芩苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含兩者9.80、186 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取2種藥材適量，按1∶1質(zhì)量比例混合后粉碎 （過40目篩），精密稱取2.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，繼續(xù)加入50 mL 60%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲 （53 Hz）45 min，放冷，60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，每1 mL溶液中含兩者各20 mg。

2.4 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，二極管陣列檢測器對全部色譜峰進行掃描分析 （220～380 nm），其中11個色譜峰所代表的成分可確定為黃酮類物質(zhì)，結(jié)果見圖1、表1。其中，峰2為蘆丁，峰4為野黃芩苷，見圖2。

表1 各黃酮吸收峰

圖1 各黃酮光譜圖

圖2 對照品、供試品UPLC色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液0.2、0.6、1.0、 1.4、 1.8、 2.2 μL， 在 “2.1” 項色譜條件下進樣測定，以進樣量為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液 1 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得蘆丁、野黃芩苷峰面積RSD分別為1.08%、0.55%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗 精密稱取樣品6份，按 “2.3”項下方法平行制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，測得蘆丁、野黃芩苷、總黃酮含有量RSD分別為0.96%、1.49%、1.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液1 μL，于0、2、4、8、12、16 h在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，測得蘆丁、野黃芩苷、總黃酮峰面積RSD分別為2.31%、1.04%、1.46%，表明溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的藥材粉末1.0 g，精密加入適量蘆丁 （0.471 2 mg／mL）、野黃芩苷（0.875 0 mg／mL）對照品，按 “2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果 （n＝6）

2.5.6 樣品含有量測定 取3批樣品，按 “2.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含有量測定結(jié)果 （n＝3）

3 討論

3.1 黃酮判斷 黃酮有2個特征吸收帶，分別為桂皮酰系統(tǒng)引起的帶Ⅰ、苯甲酰系統(tǒng)引起的帶Ⅱ［15］。白花蛇舌草中黃酮主要為槲皮素與山柰酚的苷元及其糖苷，即黃酮醇類，代表成分蘆丁；半枝蓮中黃酮主要為黃酮類，代表成分野黃芩苷［2-3］，兩者光譜特征見表5。

表5 黃酮光譜特征

3.2 供試品溶液制備方法考察 本實驗先考察超聲、回流提取，發(fā)現(xiàn)兩者提取效果相當(dāng)，故選用操作簡便的前者。然后，對提取溶劑 （20%、40%、60%、80%甲醇、純甲醇）、提取時間 （15、30、45、60 min）進行考察，發(fā)現(xiàn)60%甲醇對黃酮的親和力最高，同時提取45 min后蘆丁、野黃芩苷、總黃酮含有量不再增加，可認(rèn)為提取完全。最終確定，供試品溶液制備方法為60%甲醇超聲提取45 min。

3.3 總黃酮含有量測定方法考察 課題組前期采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法和AlCl3法測定半枝蓮-白花蛇舌草藥對總黃酮含有量，發(fā)現(xiàn)兩者均無法滿足專屬性要求，其中前者僅蘆丁在510 nm波長處附近出現(xiàn)吸收峰，而藥對與野黃芩苷在該處均未出現(xiàn) （圖3），另外一些常見黃酮（如山柰酚、黃芩苷、黃芩素、槲皮素等）顯色后在500 nm波長處無吸收或僅有弱吸收，但一些非黃酮 （如綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、香草醛等）在該處反而有最大吸收或強吸收［13］；后者專屬性相對較強，大部分非黃酮對顯色無干擾，但少數(shù)黃酮 （如橙皮苷、葛根素、蒙花苷等）在該體系下仍不產(chǎn)生顯色反應(yīng)，而且其結(jié)構(gòu)、極性差異可造成吸收峰偏移，從而影響專屬性［14］，如蘆丁、野黃芩苷分別在420、350 nm波長處附近出現(xiàn)吸收峰，而藥對在該處未出現(xiàn) （圖4）。由此可知，比色法測定總黃酮含有量時可能會造成黃酮假陰性與非黃酮假陽性問題，從而限制了其應(yīng)用。

圖3 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法光譜圖

圖4 AlCl3法光譜圖

近年來，常有文獻報道采用HPLC法代替比色法測定總黃酮含有量，該方法大多通過總黃酮水解測定黃酮苷元含有量，再經(jīng)系數(shù)換算后測得，2015年版 《中國藥典》一部中銀杏葉總黃酮醇苷含有量測定也選擇了該方法。本實驗建立UPLC-PDA法測定該成分含有量，其中PDA定性時無需進行水解等繁復(fù)的樣品前處理，更加簡便快捷；UPLC分析速度快，有利于提高測定效率，30 min內(nèi)即可完成分析。

4 結(jié)論

本實驗建立UPLC-PDA法同時測定半枝蓮-白花蛇舌草藥對中蘆丁、野黃芩苷、總黃酮的含有量，其準(zhǔn)確快速，專屬性強，可為該藥對質(zhì)量控制提供依據(jù)，也能應(yīng)用于其他成方制劑、中藥材中總黃酮含有量的測定。