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    三七近紅外多指標(biāo)快速質(zhì)量評(píng)價(jià)

    2019-04-01 12:43:20周雨楓董林毅楊哲萱張鳳蓮章順楠周立紅葉正良
    中成藥 2019年3期
    關(guān)鍵詞:筋條剪口主根

    周雨楓, 董林毅, 楊哲萱, 張鳳蓮, 章順楠, 周立紅?, 葉正良,3?

    (1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,天津300070;2.天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司,中藥先進(jìn)制造技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,天津300410;3.天士力控股集團(tuán)有限公司,天津300410)

    三七 Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen為五加科人參屬植物的干燥根和根莖物[1],屬于珍貴的中藥材。具有止血、活血化瘀、降血壓、降血脂等多種作用。近年來(lái),隨著三七產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,三七不同藥用部位的開(kāi)發(fā)研究越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。

    三七按部位分類,分為主根、筋條 (側(cè)根)、絨根 (須根)、剪口、花、葉6個(gè)部位,文獻(xiàn)指出,三七不同部位內(nèi)在成分含有量差異,可能影響臨床用藥的安全性與有效性[2]。數(shù)據(jù)顯示,生產(chǎn)合格的三七粉,在投料時(shí)需考慮不同藥用部位的質(zhì)量特征[3]。但傳統(tǒng)分析方法鑒別三七粉來(lái)源時(shí),存在耗時(shí)長(zhǎng)、前處理復(fù)雜等缺點(diǎn),且對(duì)于不同部位的三七粉,單獨(dú)采取傳統(tǒng)某種分析方法,無(wú)法對(duì)各部位判別分析,需多種分析方法綜合應(yīng)用,且隨著摻雜成分的不同,鑒別結(jié)果變數(shù)也大[4-5]。 《中國(guó)藥典》規(guī)定三七飲片可以直接以粉入藥,主要有效成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和 Rb1。但沒(méi)有規(guī)定三七粉的原料來(lái)源,藥材經(jīng)過(guò)粉碎后,失去了原來(lái)的形狀特征[6],容易摻偽。而且市售的三七主根粉容易摻雜其余部位,卻仍以主根粉原價(jià)出售,并且難以通過(guò)感官辨別。

    近年來(lái),近紅外光譜技術(shù)在中藥行業(yè)得到大力推廣,作為一種藥材快檢的高效分析方法而被廣泛應(yīng)用[3],并應(yīng)用于三七粉末的來(lái)源和真?zhèn)舞b別[7-9],但目前尚未有報(bào)道利用近紅外光譜技術(shù)對(duì)三七主根、筋條 (側(cè)根)、絨根 (須根)、剪口、花、葉等所有部位的粉末進(jìn)行判別分析。

    本研究以三七的皂苷含有量為質(zhì)控指標(biāo),利用NIRS結(jié)合PLS建立皂苷模型。同時(shí)結(jié)合主成分分析對(duì)三七不同部位分別進(jìn)行定性鑒別,應(yīng)用于三七主根粉的偽品分析,建立快速實(shí)用的多指標(biāo)分析方法,為中藥材的整體質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考[10]。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器與試劑 WATERS 269高效液相色譜儀 (美國(guó) WATERS公司);Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm,5 μm,北京迪馬科技有限公司);XS205電子分析天平 (上海梅特勒-托利多儀器有限公司);AntarisⅡ傅立葉變換近紅外光譜儀 (美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);DK-S14電熱恒溫水浴鍋 (上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);MEMMERT UNE200干燥箱 (上海美墨爾特貿(mào)易有限公司);高速中藥粉碎機(jī) (山東省青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司)。乙腈 (批號(hào) 10900830728,色譜純)、甲醇 (批號(hào)10901407732,色譜純)(德國(guó)默克股份兩合公司);甲醇 (批號(hào)2017112032,分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);三七皂苷R1(批號(hào)20130910,含有量92.78%)、人參皂苷Rg1(批號(hào)20130911,含有量94.63%)、人參皂苷Rb1(20131107,含有量95.87%)均由天士力醫(yī)藥股份有限公司提供;水為Milli-Q超純水。

    1.2 藥材 三七主根53批,三七剪口、絨根、筋條、花、葉各5批,均由天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司提供,經(jīng)浙江理工大學(xué)梁宗鎖教授鑒定為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen的主根、筋條、絨根、剪口、花、葉。藥材粉碎,過(guò)65目藥典標(biāo)準(zhǔn)篩,分別混勻,裝袋密封備用。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 HPLC 參考藥典方法[1],測(cè)得主根皂苷含有量范圍為5.85%~9.27%、筋條為5.69%~6.39%、剪口為10.12%~11.90%、絨根為4.48%~6.62%、花為2.51%~5.28%、葉為0.38%~0.69%,見(jiàn)表1。

    表1 各樣品中皂苷含有量測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of content determination of the saponins of various samples

    2.2 光譜采集 采集方式為積分球固體采樣。樣品掃描次數(shù)64次,分辨率8.0 cm-1,每個(gè)樣品采集2張光譜,計(jì)算平均光譜以建立模型。各部位三七主根的近紅外原始光譜見(jiàn)圖1。

    圖1 各樣品不同部位近紅外光譜圖Fig.1 Near-infrared spectra of different parts of various samples

    2.3 皂苷含有量模型

    2.3.1 校正集和驗(yàn)證集 應(yīng)用TQ Analyst 8.0軟件,從53批樣品中選擇具有代表性的43批作為校正集,含有量范圍分別為5.85%~9.27%,10批為驗(yàn)證集,含有量范圍為6.09%~8.96%,驗(yàn)證集的含有量范圍均在校正集之內(nèi),具有可驗(yàn)證性。

    2.3.2 光譜預(yù)處理 近紅外光譜中除了自身的光譜信息外,還容易受到儀器噪音以采集時(shí)固體粉末的顆粒大小和均一性的影響。在近紅外定性模型中,常用的預(yù)處理方法有多元散射校正法(MSC)、 標(biāo)準(zhǔn)歸一化法 (SNV)、 一階導(dǎo)數(shù)法(FD) 等[11-12]。 以 內(nèi) 部 交 叉 驗(yàn) 證 均 方 差(RMSECV)和R2作為評(píng)價(jià)指標(biāo),見(jiàn)表2,一階導(dǎo)數(shù)得到的模型數(shù)據(jù)最好。

    表2 不同預(yù)處理方法的影響Tab.2 Effects of different spectra preprocessing methods

    2.3.3 選擇建模波段 建模波段選擇范圍過(guò)窄,缺乏關(guān)鍵信息,范圍過(guò)寬又會(huì)包含大量的噪音和多余信息,因此,選擇最佳波段有利于提高模型的預(yù)測(cè)性和準(zhǔn)確性[11]。由主根近紅外譜圖可知,7 500~12 000 cm-1吸收較少, 3 800~4 000 cm-1儀器噪音比較大,不適于建模。因此選擇在 4 000~7 500 cm-1嘗試建模,以 R2、RMSECV為評(píng)價(jià)指標(biāo),手動(dòng)篩選后見(jiàn)表3。表明,4 100~7 250 cm-1為最佳建模波段。

    表3 不同波長(zhǎng)范圍的影響Tab.3 Effects of different wavelength coverage

    2.3.4 主成分?jǐn)?shù) 主成分?jǐn)?shù)量過(guò)多,模型太復(fù)雜,出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象。數(shù)量太少,則提取的信息不全面,模型的預(yù)測(cè)性降低[11]。本實(shí)驗(yàn)以RMSECV為優(yōu)化參數(shù),RMSECV越小,模型的預(yù)測(cè)精度越高[13],因此,確定最佳因子數(shù)為9。見(jiàn)圖2。

    圖2 RMSECV隨主因子數(shù)變化Fig.2 Changes of the RMSECV along with factors

    2.3.5 建立定量模型 運(yùn)用TQ Analyst 8.0軟件,通過(guò)PLS法對(duì)三七主根的皂苷含有量建立定量模型。外部驗(yàn)證中實(shí)測(cè)值與參考值的相關(guān)圖見(jiàn)圖3。結(jié)果表明,RMSECV為0.278,R2為0.919 1,表明該模型的總體預(yù)測(cè)性高。

    圖3 實(shí)測(cè)值與參考值的相關(guān)性Fig.3 Correlation between measured values and reference values

    2.3.6 模型的驗(yàn)證 根據(jù)2015版 《中國(guó)藥典》HPLC法測(cè)定的皂苷含有量作為實(shí)測(cè)值,與近紅外光譜建模后得到的預(yù)測(cè)值相比,見(jiàn)表4~5。表明,所建模型外部驗(yàn)證集的實(shí)測(cè)值與參考值最大絕對(duì)誤差0.25,平均相對(duì)誤差為1.52%,t檢驗(yàn)P值為0.210>0.05,表明驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)值與參考值之間無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明,所建模型準(zhǔn)確性高,預(yù)測(cè)性能好。

    表4 模型驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Results of the modelling verification

    表5 驗(yàn)證集參數(shù)比較Tab.5 Comparison of parameter of validation set

    2.4 各部位判別分析定性模型

    2.4.1 選擇訓(xùn)練集與驗(yàn)證集 78批樣品中隨機(jī)選擇5批主根,筋條、絨根、剪口、花、葉各1批作為驗(yàn)證集,其余作為訓(xùn)練集。訓(xùn)練集樣本68批,驗(yàn)證集樣本10批。

    2.4.2 光譜預(yù)處理 應(yīng)用TQ Analyst對(duì)樣品建立NIR判別分析定性模型時(shí),判別分析的錯(cuò)誤類別越少,正確率越高。主分成因子分析區(qū)域貢獻(xiàn)值越大表明信息越豐富,但超過(guò)95后表明光譜中噪聲對(duì)樣品自身信息干擾大,所以需要盡量控制低于95。并綜合考慮各個(gè)類別的第1主成分和第2主成分的二維散點(diǎn)圖中的區(qū)域分布是否明顯來(lái)選擇最佳的預(yù)處理方法。由表6~7得出,MSC+一階導(dǎo)數(shù)作為預(yù)處理方法正確率最高,分析區(qū)域貢獻(xiàn)值最大。

    表6 不同預(yù)處理方法的影響Tab.6 Effects of different preprocessing methods

    表7 不同預(yù)處理方法的分析區(qū)域貢獻(xiàn)值Tab.7 Contribution values of different preprocessing methods to the analysis area

    2.4.3 建模波段 建模波段選擇過(guò)寬,包含的冗余信息較多,使得模型的預(yù)測(cè)性降低;選擇過(guò)窄,對(duì)應(yīng)波段的信息不夠豐富,沒(méi)有代表性,判別分析正確率低。近紅外定性分析時(shí),波段靠近4 000 cm-1方向是合頻區(qū),越靠近往小的方向,峰的區(qū)分效果越好,重疊性越小,5 000 cm-1以上屬于倍頻區(qū),越大峰形重疊越嚴(yán)重,而越靠近10 000 cm-1峰幾乎都是重疊在一起。通過(guò)觀察譜圖差異主要在3 800~7 500 cm-1,經(jīng)過(guò)不斷手動(dòng)優(yōu)化嘗試后,得到3 807.15~6 500.00 cm-1為最佳建模波段。見(jiàn)表8。

    表8 不同波長(zhǎng)范圍的影響Tab.8 Effects of different wavelength coverage

    2.4.4 主成分判別分析模型建立 經(jīng)過(guò)上述分析,選擇 MSC+一階導(dǎo)數(shù)作為光譜預(yù)處理方法,3 807.15~6 500.00 cm-1為最佳建模波段,建立近紅外判別分析模型。見(jiàn)圖4。

    2.4.5 模型驗(yàn)證與評(píng)價(jià) 將選擇的10批樣品作為驗(yàn)證集來(lái)評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10批驗(yàn)證集樣品的類別鑒別正確率為100%。由此可得,模型的準(zhǔn)確度高,預(yù)測(cè)性能好,可用于三七不同部位的定性鑒別。

    圖4 三七不同部位第1、第2主成分得分圖Fig.4 Scores of the first and second principal components for different parts of Panax.notoginseng

    2.5 三七粉偽品

    2.5.1 三七偽品制備 三七花和三七葉的顏色相對(duì)主根而言比較深,顏色區(qū)分度比較明顯,而筋條、絨根和剪口粉末顏色與主根接近,肉眼難以準(zhǔn)確區(qū)分是否三七粉中摻有這些雜質(zhì),因此隨機(jī)選擇1批三七主根、筋條、絨根、剪口,將三者按不同比例進(jìn)行混合,見(jiàn)表9,每份樣品10 g,得到15種摻雜粉。

    2.5.2 近紅外光譜采集 分別將上述偽品粉末取約5 g置于旋轉(zhuǎn)樣品杯中,積分球固體采樣,掃描次數(shù)64次,分辨率8.0 cm-1,每個(gè)樣品采樣2次取平均光譜以建立模型。

    2.5.3 主成分判別分析 將15份偽品作為驗(yàn)證集,帶入建立的近紅外不同部位判別分析定性模型中,結(jié)果表明,該模型對(duì)三七粉中分別摻雜絨根10%、筋條45%、剪口60%及以上的偽品三七粉均可鑒別。見(jiàn)圖5。

    表9 不同比例主根與其他部位混合鑒別情況Tab.9 Mixed identification of different proportions of taproot and other parts

    3 討論

    3.1 NIRS與HPLC對(duì)比 NIRS具有高效、無(wú)損、綠色、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn),能實(shí)現(xiàn)在線分析和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),并且沒(méi)有復(fù)雜的前處理過(guò)程,能對(duì)三七各個(gè)部位通過(guò)模型進(jìn)行鑒別。然而近紅外光譜測(cè)定的是倍頻及合頻吸收,因此靈敏度較差,通常要求檢測(cè)含有量大于1%;并且NIRS作為一種間接分析方法,需要大量的建模數(shù)據(jù),基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,分析方法的精確性以及化學(xué)計(jì)量學(xué)選擇的合理性等,都會(huì)影響最終的模型精度和預(yù)測(cè)性能[14]。而HPLC法可以定量測(cè)定物質(zhì)含有量,數(shù)據(jù)精準(zhǔn),但前處理復(fù)雜繁瑣、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),且難以通過(guò)皂苷含有量來(lái)區(qū)分三七藥材的不同部位。綜合比較得出,近紅外光譜技術(shù)在推廣應(yīng)用,需要有精確的一級(jí)數(shù)據(jù)和合理的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法。

    圖5 摻雜三七粉的第一、第二主成分的得分圖Fig.5 Scores of the first and second principal components of adulterated Panax.Notoginseng powders

    3.1 定量研究 文獻(xiàn)表明,三七不同部位總皂苷溶血性小,且三七主根總皂苷的免疫增強(qiáng)作用最好[15]。多糖組分在免疫調(diào)節(jié)方面活性顯著,而三七不同部位中多糖含有量有明顯差異,主根、筋條、毛根、花、莖葉和剪口中均含有多糖,其中主根含有量最高,莖葉含有量最低[16]。主根、筋條、剪口中的皂苷含有量和種類均不同,質(zhì)量也有差異[17]。

    本實(shí)驗(yàn)測(cè)得三七不同部位中,剪口皂苷含有量最高,其次主根,接著是筋條和絨根,二者含有量范圍非常接近,而且與主根的含有量范圍有重疊部位,接下來(lái)是花和葉,葉中皂苷含有量測(cè)定范圍最低。在建立的皂苷含有量近紅外模型中,實(shí)測(cè)值平行樣品間最大偏差為1.91%,驗(yàn)證集樣品的最大相對(duì)誤差為3.42%,平均相對(duì)誤差為1.52%,表明該模型準(zhǔn)確性、預(yù)測(cè)性都較高。

    3.2 NIR判別分析 目前企業(yè)生產(chǎn)時(shí)通常選擇三七不同部位的原材料進(jìn)行加工,市售合格三七粉通常是以三七主根作為原材料,三七的筋條和須根雖然都有一定的藥用價(jià)值。但相對(duì)主根而言含有量較低,因此售價(jià)便宜,而剪口中皂苷含有量雖然比主根高,但不容易被人體直接吸收,通常用于企業(yè)制藥。三七的筋條和絨根也有一定的藥用價(jià)值,但有效成分相對(duì)較低,因此相對(duì)主根價(jià)格低廉。剪口主要成分含有量指標(biāo)要遠(yuǎn)高于法定標(biāo)準(zhǔn),但剪口和筋條的灰分指標(biāo)有不符合標(biāo)準(zhǔn)的風(fēng)險(xiǎn)[3]。

    本實(shí)驗(yàn)利用NIRS建立三七不同部位的主成分判別分析模型中,選擇MSC和一階導(dǎo)數(shù)作為預(yù)處理方法,3 807.15~6 500.00 cm-1為最佳建模波段,78批樣品中1批分類錯(cuò)誤,驗(yàn)證集分類正確率100%,總樣品分類正確率為98.72%。

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)性能和提高模型的實(shí)用性,將三七摻雜粉作為驗(yàn)證集帶入主成分判別分析模型中,在判別分析模型中,筋條、絨根和剪口含有量分別為10%、45%、60%及以上的三七摻雜粉均被鑒定出不是主根類別。經(jīng)過(guò)主成分分析后,圖5表明,隨著三七粉偽品中筋條、絨根和剪口的比例不斷增加,數(shù)據(jù)點(diǎn)不斷從主根分布區(qū)域向這三個(gè)部位的分布區(qū)域移動(dòng),表9表明,三七偽品模型鑒別準(zhǔn)確率高。

    3.3 質(zhì)量評(píng)價(jià) 本文采用近紅外光譜法,對(duì)三七主根皂苷含有量建立了定量分析模型,對(duì)三七藥材所有部位的鑒別建立了快速無(wú)損的定性分析方法。該模型經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,對(duì)三七主根粉偽品同樣具有良好的鑒別能力,具有較強(qiáng)的實(shí)用性。結(jié)果表明,近紅外光譜技術(shù)高效、便捷,可從定量和定性等多方面對(duì)三七藥材進(jìn)行整體質(zhì)量評(píng)價(jià),后期可通過(guò)不斷增加樣品量來(lái)提高各個(gè)模型的預(yù)測(cè)性和實(shí)用性。

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