基于HPLC-Q-TOF／MS法的黃芩血清藥物化學(xué)分析

李淑嬌， 王宇卿

（南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？蒲兄行?，河南南陽(yáng)473061）

黃芩始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。性寒味苦，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)。具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效［1］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)黃芩化學(xué)成分進(jìn)行了大量研究，結(jié)果顯示黃芩中成分眾多，主要包括黃酮類、揮發(fā)油類、萜類等多種類型的化合物［2-6］。但是目前關(guān)于黃芩的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還缺乏系統(tǒng)研究。中藥血清藥物化學(xué)是以傳統(tǒng)藥物化學(xué)方法為基礎(chǔ)，綜合應(yīng)用多種現(xiàn)代技術(shù)，分析鑒定口服中藥后血清中藥源性成分，研究其藥效相關(guān)性，確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的學(xué)科［7-9］。本實(shí)驗(yàn)采用中藥血清藥物化學(xué)的相關(guān)理論和研究方法對(duì)黃芩的入血成分進(jìn)行研究，旨在探求黃芩發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260高效液相色譜系統(tǒng)、G6530 QTOF／MS質(zhì)譜儀 （美國(guó)安捷倫公司）；Milli Q超純水機(jī) （美國(guó)密理博公司）；XS-105分析天平 ［梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易 （上海）有限公司］；TGL-16G高速冷凍離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）；WH-3微型渦旋混合儀 （上海滬西分析儀器有限公司）；DZF-6020真空干燥箱 （上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.2 試劑與藥品 黃芩飲片購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)課題組鑒定黃芩為 《中國(guó)藥典》收載品種，后依照2015年版 《中國(guó)藥典》項(xiàng)下要求檢驗(yàn)，合格。漢黃芩素、漢黃芩苷、黃芩苷、黃芩素 （含有量≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別 為 C19A8Q34235、 P09J8F28374、 P16S8F44143、C20M8Y31962）。乙腈為色譜純 （美國(guó)Fisher試劑公司）；超純水自制；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)SCXK （湘）2013-0004。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 稱取黃芩100 g加10倍量的水浸泡30 min后，回流提取90 min，自然冷卻后，傾出水溶液，再加 8倍量的水，回流提取60 min，自然冷卻后，傾出水溶液，過(guò)濾藥渣，合并2次濾液水浴揮干至浸膏狀，然后進(jìn)行冷凍干燥，制備樣品黃芩 （2.63 g生藥／g），冷藏備用。

2.2 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素適量，置25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得質(zhì)量濃度分別為0.718 1、 0.055 3、 0.024 0、 0.164 0 mg／mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.3 空白血清及含藥血清制備 取雄性SD大鼠12只，禁食12 h（自由飲水），稱定質(zhì)量，隨機(jī)分為2組，每組6只?？瞻捉M灌胃給予蒸餾水，給藥組灌胃給予黃芩 （4.5 g生藥／kg）提取液，每日早晚各1次，連續(xù)給藥3 d；末次給藥后30、60、120 min眼眶靜脈叢取血0.5 mL，室溫放置30 min后，3 000 r／min條件下離心10 min，取上清液血清0.2 mL，加入3倍量乙腈，渦旋混勻30 s，靜置片刻后13 000 r／min離心10 min，取上清，于真空干燥箱濃縮至干后用100 μL 70%乙腈-水復(fù)溶，渦旋，13 000 r／min高速離心10 min，取上清液作為血清供試品。

2.4 分析條件 Poroshell 120 EC-C18柱 （3 mm×150 mm， 2.7 μm）； 流動(dòng)相乙腈 （A） -0.02 mol／L醋酸銨溶液 （A）-乙腈 （B）， 梯度洗脫 （0～4 min， 2% ～24.5%A； 4～14 min， 24.5% ～26.3%A；14～17 min， 26.3% ～30% A； 17～20 min，30%～90%A；20～26 min，90%A）；體積流量0.5 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；柱溫40℃；進(jìn)樣量 5 μL。

G6530A Q-TOF／MS質(zhì)譜儀；AJS ESI源，掃描方式ESI＋、ESI－模式；干燥氣體溫度320℃；干燥氣體體積流量8 L／min；霧化器壓力275.8 kPa；鞘氣溫度300℃；鞘氣體積流量12 L／min；碎裂能量175 V；毛細(xì)管電壓3.5 kV；正負(fù)離子采集范圍m／z： 100～1 700 Da。

2.5 成分分析 取3批黃芩提取液供試品，以及6批黃芩血清樣品在相同的色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，建立HPLC色譜圖，比較分析確定進(jìn)入血液的成分。然后參照有關(guān)文獻(xiàn)、對(duì)照品對(duì)照及其一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息初步鑒定黃芩的入血成分。

3 結(jié)果

在 “2.4”項(xiàng)條件下，通過(guò)對(duì)多個(gè)采血時(shí)間點(diǎn)的血清樣品進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，大鼠灌胃給予黃芩提取液60 min后的血清樣品中成分多，各成分含有量最高，灌胃120 min后血清樣品中成分的數(shù)量和含有量均有較明顯的下降，故采用60 min的血清樣品進(jìn)行分析。

在黃芩含藥血清樣本中共檢測(cè)出13個(gè)移行成分 （圖1～2），其中1～7、11～13號(hào)峰推測(cè)為黃芩生藥中原型成分，8～10號(hào)峰推測(cè)為黃芩代謝產(chǎn)物。然后通過(guò)HPLC-Q-TOF／MS檢測(cè)，并經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)相關(guān)數(shù)據(jù)對(duì)比，初步鑒定出13個(gè)移行成分分別為6-C-阿拉伯糖基-8-C-葡萄糖基白楊素、6-C-葡萄糖基-8-C-阿拉伯糖基白楊素、黃芩苷、5，7，2′，5′-四羥基-8， 6′-二甲氧基黃酮、 千層紙素苷、 白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、6-甲氧基黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸或7-甲氧基黃芩素-6-O-葡萄糖醛酸、黃芩素葡萄糖醛酸苷、黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸甲酯或黃芩素-6-O-葡萄糖醛酸甲酯、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A，見(jiàn)表1，黃酮類化合物的特征碎裂途徑見(jiàn)圖3。

圖1 各樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various samples

圖2 各樣品總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatograms of various samples

表1 黃芩含藥血清中移行成分Tab.1 Compounds in serm after administration of S．baicalensis

圖3 黃酮類化合物特征碎裂途徑Fig.3 The feature fragmentation approach of flavonoids

化合物1，在負(fù)離子模式下，一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析中其準(zhǔn)分子離子為m／z 547.145 3，保留時(shí)間為7.182 min，進(jìn)一步進(jìn)行二級(jí)全掃描質(zhì)譜分析，其主要的碎片離子 m／z 415.103 2、253.050 5、225.055 0分別來(lái)源于準(zhǔn)分子離子失去C5H10O4、C5H10O4＋C6H10O5和 C5H10O4＋C6H10O5＋CO 后的碎片，然后通過(guò)與文獻(xiàn)對(duì)比化合物1為6-C-阿拉伯糖基-8-C-葡萄糖基白楊素［10］。化合物2，在負(fù)離子模式下，一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析中其準(zhǔn)分子離子為m／z 547.145 1，保留時(shí)間為8.151 min，進(jìn)一步進(jìn)行二級(jí)全掃描質(zhì)譜分析，其主要的碎片離子有m／z 385.092 5 ［M-H-C6H10O5］－、 m／z 253.050 5［M-HC6H10O5-C5H10O4］－和 m／z 225.055 4［M-H-C6H10O5-C5H10O4-CO］－，然后通過(guò)與文獻(xiàn)對(duì)比推斷化合物2為6-C-葡萄糖基-8-C-阿拉伯糖基白楊素［10］。 化合物6，保留時(shí)間為10.952 min，其準(zhǔn)分子離子峰為m／z 429.082 5，失去一分子葡萄糖醛酸裂解成碎片 m／z 253.050 1 ［M-C6H8O6-H］－， 碎片 m／z 253中性丟1個(gè)CO后形成碎片m／z 225.055 5［M-HC6H10O5-CO］－，然后結(jié)合文獻(xiàn)初步推測(cè)化合物6為白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷［14］。

化合物3，在8.591 min時(shí)被洗脫出來(lái)，在負(fù)離子模式下，一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析中其準(zhǔn)分子離子為m／z 445.077 5，進(jìn)一步進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，其碎片離子m／z 269.008 6比準(zhǔn)分子離子少176 Da，是由于準(zhǔn)分子離子丟失C6H8O6后形成的碎片，將黃芩苷的標(biāo)品溶液進(jìn)行HPLC-MS／MS分析，所得的一級(jí)及二級(jí)全掃描質(zhì)譜及保留時(shí)間與化合物3相同，由此確認(rèn)其為黃芩苷［11-13］。

化合物4，保留時(shí)間為9.512 min，其準(zhǔn)分子離子峰為m／z 345.061 5，失去一分子甲基后形成碎片 m／z 330.037 3 ［M-CH3·-H］－， 碎片 m／z 330.037 3分別失去一分子甲基和一分子水后形成碎片m／z 315.014 4 ［M-2CH3·-H］－和m／z 312.027 4［M-CH3·-H2O-H］－，然后結(jié)合文獻(xiàn)初步推測(cè)化合物4為5， 7， 2’， 5’ -四羥基-8， 6’ -二甲氧基黃酮［14］。

化合物5，保留時(shí)間為10.133 min，其準(zhǔn)分子離子峰為m／z 459.093 0［M-H］－，其主要碎片離子有m／z 283.060 3 ［M-C6H8O6-H］－、 m／z 269.045 3［M-C6H8O6-CH2-H］－、 m／z 241.050 4 ［M-C6H8O6-CH2-CO-H］－和 m／z 197.060 1 ［M-C6H8O6-CH2-CO2-CO-H］－，該化合物主要碎片離子與化合物7相同，但保留時(shí)間不同，表明這2個(gè)化合物為同分異構(gòu)體，化合物7通過(guò)與對(duì)照品對(duì)照確定為漢黃芩苷，然后結(jié)合文獻(xiàn)初步推測(cè)化合物5可能為千層紙素苷［11-12］?；衔?，保留時(shí)間為11.161 min，其準(zhǔn)分子離子峰為m／z 459.092 8［M-H］－，失去一分子葡萄糖醛酸裂解成碎片m／z 283.060 9［M-。碎片離子 m／z 283.060 9丟失 1個(gè)裂解成碎片m／z 269.044 9［M-C6H8O6-CH2-H］－，碎片m／z 269.044 9脫去C環(huán)C-4位CO生成碎片離子m／z 241.049 8；m／z 197.060 5離子是由碎片m／z 269.044 9失去一分子CO和一分子CO2產(chǎn)生的，然后結(jié)合對(duì)照品對(duì)照鑒定化合物7為漢黃芩苷［11-13］。

化合物11，在負(fù)離子模式下，其準(zhǔn)分子離子為269.045 1，保留時(shí)間為21.013 min，進(jìn)一步進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，結(jié)果顯示其主要碎片 m／z 251.034 6、 241.040 3、 223.039 1、 197.060 5 是準(zhǔn)分子離子分別丟失H2O、CO、H2O＋CO和CO＋CO2后形成的碎片，然后通過(guò)對(duì)照品對(duì)照鑒定化合物11為黃芩素［17］?；衔?12， 保留時(shí)間為21.926 min，其準(zhǔn)分子離子峰m／z 283.060 9［MH］－，準(zhǔn)分子離子失去1個(gè)甲基自由基裂解成碎片m／z 268.037 5［］－；碎片m／z 268.037 5脫去C環(huán)C-4位CO生成碎片離子m／z 240.042 1，失去C環(huán)4位CO和1位O生成m／z 224.047 6碎片離子；基峰離子m／z 239.034 1和m／z 223.039 2離子由碎片m／z 268.037 5分別丟失COH·和CO2H·而產(chǎn)生；m／z 212.047 3離子是由碎片m／z 268.037 5失去兩分子CO產(chǎn)生的，進(jìn)一步通過(guò)對(duì)照品對(duì)照鑒定化合物12為漢黃芩素［17］。化合物13，保留時(shí)間為22.093 min，其準(zhǔn)分子離子峰m／z 283.061 4［MH］－，準(zhǔn)分子離子分別丟失1個(gè)、一分子H2O和一分子CO裂解成碎片m／z 268.037 5［-H］－、 m／z 265.050 3 ［］－和 m／z 255.065 9［M-H-CO］－，然后通過(guò)與文獻(xiàn)對(duì)比初步推測(cè)化合物13為千層紙素A［18］。

通過(guò)對(duì)比黃芩水煎液與黃芩水煎液含藥血清的高效液相色譜圖，發(fā)現(xiàn)化合物8～10僅出現(xiàn)在黃芩水煎液含藥血清，表明這3個(gè)化合物可能為黃芩的體內(nèi)代謝物?；衔?保留時(shí)間為17.224 min，其準(zhǔn)分子離子峰為m／z 459.092 5［M-H］－，失去一分子葡萄糖醛酸裂解成碎片 m／z 283.060 3［MC6H8O6-H］－。 碎片離子 m／z 283.060 3丟失 1個(gè)裂解成碎片m／z 269.044 9 ［M-CH2-H］－， 碎片m／z 269.044 9進(jìn)一步分別丟失H2O、CO和CO＋CO2后形成碎片 m／z 251.034 6、 m／z 241.049 9、 m／z 197.060 3，根據(jù)以上信息及與文獻(xiàn)對(duì)比，初步推測(cè)化合物8為黃芩素結(jié)合一分子葡萄糖醛酸和一分子甲基后的代謝產(chǎn)物，其可能的結(jié)構(gòu)為6-甲氧基黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸或7-甲氧基黃芩素-6-O-葡萄糖醛酸［15-16］。 化合物 9， 保留時(shí)間為18.912 min，其準(zhǔn)分子離子峰為m／z 445.077 5［M-H］－，失去一分子葡萄糖醛酸裂解成碎片m／z 269.045 4［MC6H8O6-H］－；碎片m／z 269.045 4進(jìn)一步分別丟失H2O、 CO后形成碎片 m／z 251.034 1、 241.050 5；根據(jù)以上信息及與文獻(xiàn)對(duì)比，初步推測(cè)化合物9為黃芩素的葡萄糖醛酸代謝物［15-16］。

化合物10保留時(shí)間為19.321 min，其準(zhǔn)分子離子峰為m／z 459.093 0［M-H］－。其準(zhǔn)分子離子直接丟失190 Da后得到碎片m／z 269.044 7，碎片190 Da與分別丟失一分子葡萄糖醛酸和一分子甲基形成的碎片不同，這個(gè)碎片可能是甲基直接連接在了葡萄糖醛酸上形成的。碎片m／z 269.044 7進(jìn)一步丟失H2O、CO和CO＋CO2形成了黃芩素的特征碎片，然后結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)化合物10為黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸甲酯或黃芩素-6-O-葡萄糖醛酸甲酯［15-16］。

4 討論

實(shí)驗(yàn)考察了檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相等色譜條件。首先對(duì)黃芩提取液和黃芩含藥血清進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，選取色譜峰較多的波長(zhǎng)235、245、260 nm分別建立了黃芩提取液和黃芩含藥血清的色譜圖。結(jié)果表明，在波長(zhǎng)260 nm下檢測(cè)到的峰多且重現(xiàn)性好，因此選擇260 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。然后分別比較了甲醇-磷酸水溶液、甲醇-醋酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、乙腈-醋酸水溶液、甲醇-水、乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明采用乙腈-磷酸水溶液、乙腈-醋酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)黃芩提取液和黃芩含藥血清的色譜峰均較好，但是考慮到磷酸為非揮發(fā)性的酸，不能用于質(zhì)譜檢測(cè)，因此選用乙腈-醋酸水溶液；進(jìn)一步對(duì)醋酸的pH （3、3.5、4.5）進(jìn)行考察，結(jié)果表明采用0.02 mol／L的醋酸銨溶液調(diào)節(jié)醋酸pH為3.5時(shí)，各樣品色譜圖基線平穩(wěn)、重現(xiàn)性好，因此最終選擇0.02 mol／L的醋酸銨溶液加冰醋酸調(diào)pH為3.5（A）-乙腈 （B）系統(tǒng)為流動(dòng)相。然后采用以上優(yōu)選的液相條件進(jìn)行了HPLC-QTOF／MS分析，結(jié)果表明該條件下的總離子流圖中各峰分離良好，其總離子流圖信號(hào)響應(yīng)較大、干擾較小。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同血清處理方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用不同方法得到的HPLC圖譜不同，為了盡可能地表現(xiàn)出含藥血清的真實(shí)面貌，應(yīng)盡量少對(duì)含藥血清的處理步驟，以減少處理過(guò)程對(duì)圖譜產(chǎn)生的影響。本實(shí)驗(yàn)以乙腈沉淀法處理血清的處理步驟最少且雜質(zhì)峰較少、峰形較好，本實(shí)驗(yàn)選用了乙腈沉淀法進(jìn)行血清樣品處理。

目前，大多數(shù)中藥仍然采用口服給藥的方式來(lái)應(yīng)用，而絕大多數(shù)給藥后只有移行入血的成分才有可能發(fā)揮藥效。因此，通過(guò)分析口服給藥后血清中的成分來(lái)確定中藥的體內(nèi)直接作用物質(zhì)，已成為快速、準(zhǔn)確地研究確定其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用中藥血清化學(xué)的研究方法結(jié)合HPLC-QTOF／MS技術(shù)，對(duì)中藥黃芩口服吸收后的含藥血清中的原型成分及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行綜合研究，結(jié)果表明黃酮類及其代謝產(chǎn)物是黃芩入血的主要成分，現(xiàn)代藥理研究表明黃芩中黃酮類成分具有解熱、抗炎、抗菌、抗缺血再灌注損傷等多種藥理活性。因此，可以在黃芩血清藥物化學(xué)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探明黃芩中各效應(yīng)成分和藥理作用的對(duì)應(yīng)關(guān)系，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行藥效學(xué)及成藥性的系統(tǒng)研究，以期從中開(kāi)發(fā)出作用顯著、機(jī)理明確的創(chuàng)新藥物。