基于多元統(tǒng)計分析的不同產(chǎn)地莪術飲片質(zhì)量評價

顧麗亞， 胡 瑋， 陸兔林，2?， 郝 敏， 毛春芹?， 季 德，2

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京210023；2.江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇南京210023）

莪術來源于姜科植物蓬莪術Curcuma phaeocaulis Valeton、廣西莪術Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，具有行氣破血、消積止痛的功效［1］?，F(xiàn)代研究表明莪術具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、抗腫瘤、抗癲癇和抗菌等［2-9］，倍半萜和姜黃素類成分是其發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎。文獻表明不同產(chǎn)地土壤、光照、水分、溫度等環(huán)境因素有差異，造成中藥次生代謝產(chǎn)物積累不同，影響藥材品質(zhì)，進而導致中藥飲片質(zhì)量不一［10-11］。莪術主產(chǎn)于廣西、四川、浙江等地［12］，作為臨床常用的中藥飲片，其品質(zhì)好壞關系到用藥的安全性和有效性。在質(zhì)控方面，2015版 《中國藥典》僅以揮發(fā)油得率為評價指標，不能全面評價莪術飲片的質(zhì)量。目前，關于莪術飲片質(zhì)量分析的文獻較多，但研究主要針對莪術飲片炮制前后化學成分變化情況，不同產(chǎn)地各自收集的批次較少，不具有統(tǒng)計學意義［13-14］。

本實驗采用HPLC法測定了30批不同產(chǎn)地莪術飲片中5個倍半萜類成分 （β-欖香烯、呋喃二烯、吉馬酮、莪術醇、莪術二酮）和3個姜黃素類成分 （雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素）的含有量，結(jié)合聚類分析 （HCA）［15］、主成分分析 （PCA）［16-17］和正交偏最小二乘法（O2PLS-DA）［18］等多元統(tǒng)計分析方法，篩選出不同產(chǎn)地莪術飲片化學成分差異的標志性成分，系統(tǒng)、客觀地評價質(zhì)量差異，為其臨床用藥提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀 （美國安捷倫公司）；HL-350 A型高速多功能粉碎機 （上海塞耐機械有限公司）；FA1104型電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；Mettler AG285電子分析天平 （瑞士梅特勒-托利多集團）；KQ-500E型醫(yī)用超聲清洗器 （昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥 β-欖香烯對照品 （批號170802）、呋喃二烯對照品 （批號170510）、莪術醇對照品 （批號170515）均購于南京森貝伽生物科技有限公司；吉馬酮對照品 （批號lw17040709）、莪術二酮對照品 （批號lw17101103）、姜黃素對照品 （批號lw17091410）、去甲氧基姜黃素對照品 （批號lw16090803）、雙去甲氧基姜黃素對照品 （批號lw16090905）均購于南京良緯生物科技有限公司。乙腈 （色譜純，德國Merck公司）；甲醇 （色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司）；甲酸 （色譜純，美國Anaqua chemicals supply公司）；無水乙醇 （分析純，無錫市亞盛化工有限公司）；Milli-Q超純水 （南京漢隆實驗器材有限公司）。

30批莪術飲片中，20批購于不同飲片生產(chǎn)企業(yè)，10批由浙江省瑞安市通明溫郁金專業(yè)合作社提供藥材，自行炮制。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院陸兔林教授鑒定，植物基原分別為蓬莪術Curcuma phaeocaulis、廣西莪術Curcuma kwangsiensis S.G.lae et C.F Liang或溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖。分別取凈莪術參照2015版 《中國藥典》制得浙江產(chǎn)地的莪術飲片。信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent pro shell C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相0.5‰甲酸乙腈（A） -0.5‰甲酸水 （B）， 梯度洗脫 （0～10 min，40%～50%A；10～20 min，50% ～75%A；20～25 min，75% ～95%A； 25～30 min， 95%A； 30～35 min，95% ～40%A； 35～40 min， 40%A）； 柱溫30℃； 體積流量 1 mL／min； 檢測波長 216、415 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取β-欖香烯、呋喃二烯、吉馬酮、莪術醇、莪術二酮對照品適量，加甲醇定容，分別配制成質(zhì)量濃度為 2.714、0.508、 0.254、 0.496、 0.601 mg／mL 的倍半萜類混合對照品貯備液；精密稱定雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素對照品適量，加甲醇定容，分別配制成質(zhì)量濃度為 0.011、0.051、0.071 mg／mL的姜黃素類混合對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液制備 取莪術飲片適量，粉碎，過3號篩，精密稱取0.5 g粉末，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL的70%乙醇，稱定質(zhì)量，超聲30 min（功率250 W，頻率20 kHz），補足減失質(zhì)量，過0.45 μm微孔濾膜。

2.3 方法學考察

圖1 各樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various samples

2.3.1 線性關系考察 依次精密吸取0.2、0.4、1.0、2.0、5.0 mL的混合對照品貯備液于10 mL量瓶內(nèi)，加甲醇定容，制得系列對照品溶液。每個質(zhì)量濃度分別進樣2次，以峰面積平均值為縱坐標（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標 （X），進行回歸，結(jié)果見表2。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣 6次， 測得 β-欖香烯、 呋喃二烯、吉馬酮、莪術醇、莪術二酮、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積RSD值分別為0.89%、0.22%、0.27%、0.88%、0.83%、0.92%、1.15%、0.64%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 選擇同一批莪術粉末 （S3），平行6份，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1” 項色譜條件下進樣，測得 β-欖香烯、呋喃二烯、吉馬酮、莪術醇、莪術二酮、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素質(zhì)量濃度RSD值分別為1.46%、0.37%、0.72%、1.56%、1.39%、0.93%、1.88%、1.05%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 選擇供試品 （S3）， 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h在 “2.1”項色譜條件下進樣，測得β-欖香烯、呋喃二烯、吉馬酮、莪術醇、莪術二酮、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積RSD值分別為1.43%、0.51%、1.00%、0.90%、0.94%、0.47%、0.90%、0.39%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱定9份已知質(zhì)量濃度的供試品 （S3）粉末各0.25 g，每3份分別精密加入供試品中各成分含有量50%、100%、150%對照品溶液，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣，計算加樣回收率。結(jié)果表明，β-欖香烯、呋喃二烯、吉馬酮、莪術醇、莪術二酮、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的加樣回收率分別為99.75%、98.96%、 99.36%、 98.32%、 97.82%、 99.23%、96.87%、97.67%，RSD分別為 1.23%、1.51%、0.90%、0.85%、0.47%、0.98%、1.90%、1.24%。2.4 樣品含有量測定 30批莪術飲片按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，每個樣品平行3份，在“2.1”項色譜條件下進樣，計算平均含有量，結(jié)果見表3。

2.5 多元數(shù)據(jù)分析 使用simca-p14.1軟件對30批樣品進行HCA分析。以莪術飲片8種化學成分的含有量為變量，采用組間Ward聯(lián)結(jié)法，將歐式距離平方和作為樣本測度，結(jié)果見圖2。表明，3個產(chǎn)地的莪術飲片明顯聚為3類，四川與廣西產(chǎn)地的莪術更為接近，總體來說，溫莪術各成分含有量相對其他2個主產(chǎn)地較高。

圖2 30批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of thirty batches of samples

為了進一步探討3個產(chǎn)地莪術飲片之間的差異，使用非監(jiān)督模式識別方法PCA對含有量測定數(shù)據(jù)進行分析，見圖3。根據(jù)得分矩陣圖，第一主成分的貢獻率為59.5%，第二主成分的貢獻率為31.8%，累計貢獻率高達91.3%，表明模型擬合能力良好，能較全面的體現(xiàn)樣品之間的差異。30批莪術飲片被分為3類，PCA分析與HCA分析結(jié)果相似。

圖3 30批樣品主成分分析圖Fig.3 PCA plot for thirty batches of samples

最后，采用監(jiān)督模式識別方法O2PLS-DA對不同產(chǎn)地莪術飲片進行分析，見圖4。該O2PLS-DA模型， R2Xcum＝0.992， R2Ycum＝0.935， Q2cum＝0.92。其中，R2Xcum反映X矩陣結(jié)實率，R2Ycum概括模型的穩(wěn)定性，Q2cum體現(xiàn)模型的預測性；R2Ycum和Q2cum的值越接近1，模型的穩(wěn)定性和預測性越好。結(jié)果表明，該模型穩(wěn)定可靠，30批樣品聚類較好，分離顯著，與PCA分析、HCA分析結(jié)果相互驗證。結(jié)合變量重要性投影值 （VIP），篩選出對莪術分類貢獻較大的主要成分，見圖5。一般認為，VIP＞1的變量對分類起著關鍵作用，而且值越大對分類的貢獻越大。由圖可知，VIP＞1.0的有5個變量，按VIP值大小依次為姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、莪術二酮、呋喃二烯。

圖4 30批樣品O2PLS-DA得分圖Fig.4 O2PLS-DA score plot of thirty batches of samples

圖5 30批樣品O2PLS-DA模型中8個主成分的VIP值Fig.5 VIP values of eight chromatographic peaks in O2PLS-DA model of thirty batches of samples

3 討論

在供試品溶液制備方面，考察了不同的提取方式，結(jié)果表明，超聲和索氏回流提取效率相近，但前者更節(jié)約時間，因此選擇超聲提取。結(jié)合參考文獻，分別考察了不同溶劑 （30%、50%、70%、90%乙醇）、提取時間 （15、30、45、60 min）、液料比 （20、40、60、80），確定最佳供試品溶液制備方法為40倍量70%乙醇超聲提取30 min。同時對色譜條件進行考察，包括色譜柱 （Hanbon ODS-2 C18色譜柱、Agilent pro shell C18色譜柱）、流動相系統(tǒng) （乙腈-水、乙腈-甲酸水、乙腈甲酸-甲酸水）、梯度洗脫、體積流量、柱溫、波長等，綜合考慮基線噪聲、對稱因子、分離度、洗脫時間等因素，確定最佳色譜條件。

本實驗采用HPLC測定了30樣品中8種成分的含有量，該方法操作簡便、準確度高、重現(xiàn)性好。結(jié)合模式識別方法對莪術飲片含有量進行深入分析，結(jié)果表明不同產(chǎn)地的莪術飲片可明顯分為3類，表明不同產(chǎn)地的莪術飲片質(zhì)量差異較大，其中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、莪術二酮、呋喃二烯等幾個成分對分類的貢獻較大，莪術醇、吉馬酮、β-欖香烯等幾個成分差異小。目前，2015版 《中國藥典》規(guī)定莪術有3個基原，但不同產(chǎn)地莪術飲片有效成分的種類和含有量均存在較大差異，以期2020版 《中國藥典》分列制訂不同產(chǎn)地莪術飲片含有量的標準。本實驗收集的莪術飲片產(chǎn)地有限，后續(xù)研究希望增加非道地產(chǎn)區(qū)的樣本量，為不同產(chǎn)地、不同基原莪術飲片的區(qū)分及質(zhì)量評價提供更加全面的理論依據(jù)。