蜘蛛香化學(xué)成分及其抗腫瘤活性

譚玉柱， 楊 凡， 李 博， 沈曉飛， 岳美穎， 李文兵， 孟 江， 李鴻翔?，張 海?

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室—省部共建國家實驗室培育基地，四川成都611137；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院，四川成都610041；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，四川成都611137；4.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，國家中醫(yī)藥管理局 “中藥配方顆粒質(zhì)量與療效評”重點研究室，四川彭州610031）

本品為敗醬科纈草屬植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的根及根莖。秋季采挖，除去泥沙，曬干所得，有馬蹄香、小馬蹄香、九轉(zhuǎn)香等別稱。其藥性辛、微苦，溫，具有理氣止痛、鎮(zhèn)靜安神、祛風(fēng)除濕以及消食止瀉的作用，民間主要用于治療脘腹脹痛、失眠、腰膝酸軟、風(fēng)濕痹痛、腹瀉痢疾以及食積不化等［1］。蜘蛛香分布于中國西南地區(qū)和印度等地，在我國，蜘蛛香主要分布于貴州、四川、云南等?。?］。其根和根莖中主要含有環(huán)烯醚萜類、木脂素類、揮發(fā)油類和倍半萜類化合物，其中環(huán)烯醚萜結(jié)構(gòu)已成為抗癌藥物篩選的基礎(chǔ)藥效結(jié)構(gòu)［3］。本研究所得化合物中，化合物1～3為環(huán)烯醚萜成分、4為倍半萜、5為苯丙素類，其中化合物5為首次從該屬植物中分離，化合物2～3有較強的抗腫瘤活性。

1 儀器與材料

UPT-I-10T超純水器 （成都超純科技有限公司）；BS124S電子天平 （德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （亞榮生化儀器）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長城科技工貿(mào)有限公司）；Bruker BioSpin GmbH 400超導(dǎo)核磁共振儀 （德國Bruker公司）；LC-10AT高效液相色譜儀 （日本島津公司）；ZO RBAX SB-C18色譜柱 （美國Waters公司）；SW-CJ-2FD凈化工作臺 （蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ALLEGER X-12離心機（美國Beckman公司）；varioskan flash-3001酶聯(lián)免疫檢測儀 （美國Thermo scientific公司）；3111培養(yǎng)箱 （美國Thermo公司）。

Sephadex LH-20（瑞士Pharmacia公司）；MCI（日本三菱化學(xué)公司）；薄層色譜硅膠GF254和柱色譜硅膠 （200～300目，青島海洋化工廠）。色譜甲醇和乙腈 （賽默飛世爾科技中國有限公司）。DMEM高糖培養(yǎng)基 （批號1715848，美國Thermo公司）；新生牛血清 （批號140930，浙江天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶 （批號 EXP2018／06，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。磷酸鹽緩沖液（批號150907，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司PBS）。三氯醋酸 （TCA） （批號2016080101，成都科龍化工試劑廠）；磺酰羅丹明B（SRB） （批號mkbq6027v，美國Sigma公司）。

2 提取與分離

蜘蛛香干燥根及根莖粉末20 kg，室溫下用95%乙醇浸漬24 h后滲漉提取 （20 L×8次），滲漉液40℃下減壓濃縮至無醇味 （2 L），依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到石油醚（420 g）、 乙酸乙酯 （370 g）、 正丁醇 （360 g） 部位。取石油醚部位，加適量石油醚溶解后，適量硅膠拌樣，干燥得樣品硅膠1 000 g。采用干法裝柱（1.2 m×20 cm），石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（100∶0～0∶100），經(jīng)薄層檢測合并主斑點，濃縮后得9個組分 （Fr.1-9）。

Fr.3段經(jīng)硅膠柱色譜分離，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫 （50∶0～1∶1），合并得 5個組分（Fr.3.1-Fr.3.5）。 Fr.3.2部分經(jīng) Sephadex LH-20（CH2Cl2-CH3OH 4∶6） 和硅膠柱 （PE-PA 10∶1）分離，最后經(jīng)制備薄層 （PE-PA 2∶1），得化合物5（16 mg）。Fr.3.3經(jīng)中壓制備液相色譜 （CH3OHH2O 40∶60～100 ∶0）， 硅膠柱 （PE-EA 3 ∶1） 洗脫，再經(jīng)HPLC柱，以CH3OH-H2O （60∶40）洗脫，得化合物2（21.2 mg）。Fr.5段經(jīng)硅膠柱分離，用CH2Cl2-CH3OH （10∶0～1∶1） 梯度洗脫，合并得 5個組分 （Fr.5.1-Fr.5.5）。Fr.5.5經(jīng)Sephadex LH-20（CH2Cl2-CH3OH 1∶1） 純化，得化合物1（18 mg）。Fr.6段經(jīng)MCI柱，以CH3OHH2O（20∶80～0∶100）洗脫，得 5個組分（Fr.6.1-Fr.6.5）。 Fr.6.3經(jīng) Sephadex LH-20柱（CH3OH） 分離，得 6 個組分 （Fr.6.3.1-Fr.6.3.6）。Fr.6.3.3經(jīng)制備薄層色譜，CH2Cl2-CH3OH （5∶1） 展開，得化合物 4（14 mg）。Fr.6.3.4經(jīng) HPLC柱，以 CH3OH-H2O （30∶70）洗脫，最后通過制備薄層色譜 （CH2Cl2-CH3OHH2O 4∶1∶0.1）為展開劑，得化合物3（38 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色油狀液體。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ： 1.04 （3H， d， J＝7.3 Hz， H-11）， 1.40（3H，s， H-10）， 1.64 （1H， m， H-4）， 1.65 （1H，ddd， J＝13.8， 6.7， 3.5 Hz， H-6a）， 1.83 （1H， m，H-9）， 1.98 （1H， m， H-5）， 2.11 （1H， dd， J＝13.9， 7.4 Hz， H-6β）， 3.89 （1H， dd， J＝7.4， 3.5 Hz， H-7）， 4.09 （1H， d， J＝ 1.8 Hz， H-1）， 4.64（1H， d， J ＝ 2.9 Hz， H-3）；13C-NMR （100 MHz，CDCl3） δ： 59.8 （C-1）， 94.0 （C-3）， 43.9 （C-4），40.2 （C-5）， 43.1 （C-6）， 79.7 （C-7）， 81.4 （C-8），38.4 （C-9）， 18.5 （C-10）， 18.1 （C-11）。 以上數(shù)據(jù)和文獻 ［4］ 一致，故鑒定為 （3S，4S，5S，7S， 8S， 9S） -3， 8-ethoxy-7-dihydroxy-4， 8-dimethylperhydrocyclopenta- ［c］ pyran。

化合物 2：黃色油狀液體。HRESIMS m／z：431.204 4 ［M ＋ Na］＋（calcd for C22H32O7Na，431.204 6）。1H-NMR （400 MHz， CDCl3） δ： 0.97（12H， m， H-4′， 5′， 4″， 5″）， 2.03 （2H， d， J＝5.6 Hz， H-6），2.06 （3H， s， H-2?），2.11 （1H， m， H-3′， 3″）， 2.33 （1H， m， H-2′， 2″）， 2.93 （1H， m，H-5，9），4.43 （1H， d， J＝12.3 Hz， H-10α），4.63（1H， d， J＝ 12.3 Hz， H-10β）， 5.36 （1H， s， H-11α）， 5.45 （1H， s， H-11β）， 5.52 （1H， t， J＝5.0 Hz， H-7）， 5.90 （1H， d， J＝ 5.6 Hz， H-1）， 6.43（1H， s， H-3）；13C-NMR （100 MHz， CDCl3） δ： 90.4（C-1）， 142.0 （C-3）， 111.5 （C-4）， 33.9 （C-5），37.0 （C-6）， 74.9 （C-7）， 147.1 （C-8）， 43.2 （C-9）， 63.6 （C-10）， 116.2 （C-11）， 171.7 （C-1′），43.6 （C-2′）， 25.7 （C-3′）， 22.5 （C-4′）， 22.5 （C-5′）， 173.1 （C-1″）， 43.4 （C-2″）， 25.9 （C-3″），22.5 （C-4″）， 22.5 （C-5″）， 170.6 （C-1?）， 21.4（C-2?）。以上數(shù)據(jù)和文獻 ［5］一致，故鑒定為desoxidodidrovaltrate。

化合物3：黃色油狀液體。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ： 0.94 （6H， d， J ＝ 6.6 Hz， H-4′， 5′），2.02 （3H， s， H-2″）， 2.08 （2H， m， H-2′）， 3.97（1H， s， H-9）， 4.23 （1H， d， J＝ 10.0 Hz， H-10α）， 4.33 （1H， d， J＝ 10.0 Hz， H-10β）， 4.90（2H，s，H-11），5.29（1H，s，H-1），6.83（1H，d，J＝5.6 Hz， H-7）， 6.87 （1H， d， J＝5.5 Hz， H-6），9.93 （1H， s， H-3）；13C-NMR （100 MHz， CDCl3） δ：103.0 （C-1）， 190.8 （C-3）， 127.7 （C-4）， 163.2（C-5）， 134.7 （C-6）， 145.3 （C-7）， 95.5 （C-8），58.6 （C-9）， 70.9 （C-10）， 57.8 （C-11）， 173.0（C-1′）， 43.2 （C-2′）， 25.8 （C-3′）， 22.4 （C-4′），22.4 （C-5′）， 171.1 （C-1″）， 21.0 （C-2″）。 以上數(shù)據(jù)和文獻 ［6］一致，故鑒定為valtral C。

化合物4：白色無定型粉末。HRESIMS m／z：261.180 3 ［M ＋Na］＋（calcd for C15H26O2Na，261.183 0）。1H-NMR （400 MHz， CDCl3） δ： 0.79（3H， d， J＝6.7 Hz， H-15）， 0.89 （3H， s， H-14），1.11 （3H， s， H-12）， 1.23 （3H， s， H-13）， 3.91（1H， m， H-8）；13C-NMR （100 MHz， CDCl3） δ：75.3 （C-1）， 32.7 （C-2）， 28.7 （C-2）， 28.2 （C-4）， 42.6 （C-5）， 24.2 （C-6）， 46.9 （C-7）， 72.7（C-8）， 39.5 （C-9）， 39.6 （C-10）， 40.5 （C-11），25.5 （C-12）， 27.8 （C-13）， 20.3 （C-14）， 19.0（C-15）。以上數(shù)據(jù)和文獻 ［7］一致，故鑒定為8-hydroxyl-pathouli alcohol。

化合物5：黃色油狀液體。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ： 3.95 （3H， s， 3′-OCH3）， 3.99 （3H， s，4′-OCH3）， 6.59 （1H， dd， J＝15.8， 7.7 Hz， H-2），6.96 （1H， d， J＝8.2 Hz， H-5′）， 7.07 （1H， d， J＝1.9 Hz， H-2′）， 7.13 （1H， dd， J＝8.2， 1.9 Hz， H-6′）， 7.40 （1H， d， J＝15.8 Hz， H-3）， 9.65 （1H，d， J＝ 7.7 Hz， H-1）；13C-NMR （100 MHz， CDCl3）δ： 193.7 （C-1）， 153.1 （C-2）， 115.1 （C-3），126.9 （C-1′）， 124.2 （C-2′）， 146.6 （C-3′）， 149.1（C-4′）， 109.6 （C-5′）， 126.6 （C-6′）， 56.2 （3′-OCH3）， 56.9 （4′-OCH3）。 以上數(shù)據(jù)和文獻 ［8］一致，故鑒定為3，4-二甲氧基肉桂醛。

4 抗腫瘤活性篩選

將胃癌MGC803、肝癌HepG2細胞以3 000～5 000個／孔的密度接種至96孔板，37℃孵育過夜。隨后加入不同濃度的化合物，使其終濃度為0、0.5、 1、 2、 4、 8、 16 μmol／L。 以 DMSO 作為空白對照，KPT330為陽性對照，繼續(xù)孵育72 h。孵育結(jié)束后，棄去細胞培養(yǎng)基，加入100 μL預(yù)冷的1%TCA，4℃固定1 h。棄去固定液，以去離子水清洗5遍，37℃烘干后，每孔加入100 μL的0.4%磺酰羅丹明B（1%乙酸配制）染液，室溫下染色10 min，未與蛋白質(zhì)結(jié)合的SRB用1%醋酸洗5遍，37℃烘干。與蛋白質(zhì)結(jié)合的 SRB用 150 μL的10 mmol／L非緩沖 Tris堿液 （pH＝10.5） 振蕩溶解。最后，于560 nm處測定各孔吸光度值 （OD），計算細胞相對增值率。相對增值率＝ （OD給藥－OD空白） ／（ODDMSO－OD空白） ×100%， 以 Graphad Prism 5統(tǒng)計分析軟件計算藥物的IC50。結(jié)果見圖1，表明化合物2～3對胃癌MGC803和肝癌HepG2增殖均顯示一定的抑制活性，其IC50分別為4.28、1.90 μmol／L 和 4.96、 2.54 μmol／L。

圖1 化合物2～3對癌細胞MGC803、HepG2的抑制活性Fig.1 Inhibitory effects of compounds 2－3 on cancer cells of MGC803 and HepG2

5 討論

環(huán)烯醚萜成分是蜘蛛香的主要成分，此類成分被認為具有抗癌活性藥物的基礎(chǔ)藥效結(jié)構(gòu)［3］。在雌性KREBSⅡ腹水癌小鼠的抗癌活性實驗中，環(huán)烯醚萜成分didrovaltrate可治療腹水癌小鼠，48 h內(nèi)腹水減退，約一半小鼠癥狀緩解，且有多于6個月的存活時間，而對照組通常在接種后 （15±2）d內(nèi)死亡。體外實驗表明，化合物 didrovaltrate和valtrate在質(zhì)量濃度為33 mg／L時對大鼠的肝癌細胞有顯著的抑制作用［9］。肝細胞瘤超微結(jié)構(gòu)也顯示這2個化合物能引起膜微絨毛的消失，大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膨大和線粒體的顯著縮合［10］。最近研究發(fā)現(xiàn)，纈草三酯 （纈草素）提取物顯示出較單體成分valtrate和didrovaltrate更顯著的抗結(jié)腸癌和抗肝癌活性［11］。同時蜘蛛香提取物對人結(jié)腸癌SW480細胞有明顯的增殖抑制和抗轉(zhuǎn)移作用［12］。

蜘蛛香為纈草屬的一種，在歐洲纈草有悠久的應(yīng)用歷史，可作藥用和香料。纈草已被列入 《歐洲藥典》，其制劑被荷蘭、德國、日本、英國等20多個國家藥典收載［13］。北纈草V．fauriei B.生長在中國東北地區(qū)，已有上百年的臨床應(yīng)用歷史［14］。經(jīng)didrovaltrate治療存活的雌性KREBSⅡ腹水癌小鼠，50 d后與健康雄鼠交配后能正常受孕，產(chǎn)下的第一代小鼠既無病態(tài)也無畸形［9］。蜘蛛香中環(huán)氧單烯型環(huán)烯醚萜IVHD-valtrate的體內(nèi)外抗腫瘤實驗也表明IVHD-valtrate具有高效低毒的抗腫瘤作用［15-16］。有學(xué)者從急性毒性及長期毒性兩方面證實了蜘蛛香環(huán)烯醚萜成分臨床用藥的安全性［17］。更值得一提的是，新近研究表明纈草環(huán)烯醚萜成分在發(fā)揮抗癌作用的同時，還能增強機體的免疫功能［18］。蜘蛛香中的環(huán)烯醚萜成分抗腫瘤作用具有獨特的優(yōu)勢和特點，殺傷癌細胞的同時，還能抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移；幾乎無毒性，臨床用藥安全；增強免疫效用。由此可見，蜘蛛香中的環(huán)烯醚萜成分可成為抗癌藥物開發(fā)的理想選擇，然而其穩(wěn)定性可能也是制約成藥性的瓶頸，需要進一步結(jié)構(gòu)改造以增加其穩(wěn)定性。