蘇合香對大鼠心肌缺血的影響

陳 念， 王 建， 樊亞梅， 馬 驍， 郭曉慶， 董泰瑋， 馬 榮， 謝 倩

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137）

蘇合香為金縷梅科植物蘇合香樹Liquidambar orientalis Mill．樹干滲出的香樹脂，經(jīng)加工精制而成，其味辛、性溫，歸心、脾經(jīng)，具有開竅、辟穢、溫散止痛功效［1］，臨床上常與芳香溫通藥配伍以治療胸痹心痛，如蘇合香丸。本實驗探討蘇合香對心肌缺血大鼠的影響，為闡釋該藥材抗急性心肌缺血研究提供實驗基礎(chǔ)，進(jìn)而為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 健康成年SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量230～270 g，雌雄各半，購于成都達(dá)碩實驗動物研究所，合格證號SCXK（川）2013-15，于成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)。然后，在成都中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級科研實驗室進(jìn)行實驗 （編號TCM-09-315）。

1.2 試藥 蘇合香購于西南藥都中藥材市場。生理鹽水 （四川科倫藥業(yè)股份有限公司，M14110208）；硝酸甘油 （上海信誼藥廠有限公司，批號F31021149）；吐溫 （天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，批號20150104）；水合氯醛 （成都市科龍化工試劑廠，批號2013101801）。

參考課題組前期報道［2］，用5%吐溫配制藥液，給藥劑量參照2015版 《中國藥典》，分別以成人 （60 kg） 日用量 （蘇合香 1 g） 的 40、20、10倍作為高、中、低劑量，即 0.667、0.333、0.167 g／kg。陽性藥硝酸甘油用5%吐溫配制藥液，按照成人 （60 kg）日用劑量 （每次0.5 mg，每天不超過3次）及前期預(yù)實驗所選有效劑量（1 mg）， 配制為人體等效劑量0.01 mg／kg。

1.3 儀器 UPH-1-10T優(yōu)普超純水制造系統(tǒng) （成都超純科技有限公司）；BP11D電子天平 ［賽多利斯科學(xué)儀器 （北京）有限公司］；KQ5200E型超聲儀 （昆山市超聲儀器有限公司）；手術(shù)器械（蘇州六六視覺科技股份有限公司）；BL-420S生物系統(tǒng)分析儀 （成都泰盟科技有限公司）；肌酸激酸同工酶檢測試劑盒 （批號20180317）、GOT試劑盒 （批號20180315）、LDH微板檢測盒 （批號20180515） （南京建成生物工程研究所）；酶標(biāo)儀 （南京華東電子集團(tuán)有限公司，批號DG5032）。

2 方法

2.1 分組及給藥 將84只大鼠按體質(zhì)量、性別隨機分為假手術(shù)組、模型組、溶劑組、陽性藥組及蘇合香高、 中、 低劑量組 （0.167、 0.333、 0.667 g／kg）， 每組12只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后給藥，蘇合香組均按20 mL／kg劑量灌胃給予相應(yīng)藥液，陽性藥組灌胃給予硝酸甘油溶液，模型組與假手術(shù)組灌胃給予生理鹽水，溶劑組灌胃給予5%吐溫，1次／d，連續(xù)3 d。給藥前，大鼠禁食不禁水12 h，末次灌胃30 min后造模，造模后第2天繼續(xù)灌胃給藥，1 次／d， 連續(xù) 3 d。

2.2 造模 第3天預(yù)給藥30 min后，腹腔注射100 g／L水合氯醛 （300 mg／kg） 麻醉， 背位固定，行氣管插管，連接呼吸機輔助呼吸。將Ⅱ?qū)?lián)針狀電極連于BL-420四通道生物信號分析系統(tǒng)。大鼠胸部去毛消毒后，沿左胸骨旁線剪開皮膚，分離肌肉，暴露肋骨，剪開第3、4根肋軟骨之間的間隙，擴胸器擴寬，暴露心臟，小彎針4／0號絲線從肺動脈圓錐左緣進(jìn)入，在左心耳下緣2 mm進(jìn)針，深度約0.5 mm，連同穿過的心肌水平結(jié)扎冠狀動脈LAD［3-5］（假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎），監(jiān)測心電圖，當(dāng)ST段下移大于0.1 mV即為造模成功，排除淤血和空氣，縫合線依秩縫合胸腔、皮膚，大鼠恢復(fù)自主呼吸后停止人工呼吸，放于籠內(nèi)飼養(yǎng)。

2.3 心電圖、血流動力學(xué)指標(biāo)測定 第6天給藥30 min后， 腹腔注射100 g／L 水合氯醛（300 mg／kg）麻醉，背位固定，將針狀電極、心導(dǎo)管連接于BL-420四通道生物信號分析系統(tǒng)。大鼠頸部剪毛，仔細(xì)分離右頸總動脈，插入充有肝素生理鹽水的心導(dǎo)管至左心室，連接壓力傳感器監(jiān)視心室內(nèi)壓，記錄5、10、15、20 minⅡ?qū)?lián)心電圖指標(biāo)。 以及 5、10、 15、 20、 25、 30、 35、 40 min 左 室 平 均 壓（LVAP）、 左室舒張期末壓 （LVEDP）。

2.4 心梗死率測定 實驗結(jié)束后，大鼠心臟剪去心耳，切成5片，37℃下于1%TTC溶液中溫孵15 min，4%多聚甲醛固定24 h，正常心肌染為紅色，梗死心肌不著色或淺著色，稱取左心室質(zhì)量，再剪取梗死心肌稱定質(zhì)量，計算心肌梗死面積百分比 （梗死心肌質(zhì)量／左心室質(zhì)量×100%）。

2.5 心肌組織HE染色 取出大鼠心臟，于冰生理鹽水中洗去余血，濾紙吸去多余生理鹽水，10%福爾馬林固定，沿左右心室縱面靠近結(jié)扎處取材，脫水，石蠟包埋，制片 （厚度4 μm），HE染色，進(jìn)行病理切片，光鏡下分別觀察各組心肌中性粒細(xì)胞浸潤、水腫、充血、出血、細(xì)胞變性、壞死情況。無病變計0分，病變面積小于10%計1分，10%～20%計2分，30%～50%計3分，大于50%計4分。

2.6 血清生化指標(biāo)測定 心電采集完畢之后，大鼠腹主動脈取血，靜置15～30 min，3 500 r／min離心10 min，取血清上清液，按試劑盒操作步驟檢測大鼠血清AST、LDH、CK-MB活性。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS21.0進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以 （±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析。P＜0.05表示有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 蘇合香對ST段的影響 表1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組于5、10、15、20 minST段均顯著下移 （P＜0.01）；與溶劑組比較，蘇合香中劑量組各時間點ST段均顯著回移 （P＜0.05，P＜0.01），而高劑量組于5、10 min顯著回升 （P＜0.01）。

表1 蘇合香對ST段的影響 （±s， n＝12）Tab.1 Effect of Styrax on ST segment（±s， n＝12）

表1 蘇合香對ST段的影響 （±s， n＝12）Tab.1 Effect of Styrax on ST segment（±s， n＝12）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與溶劑組比較，▲P＜0.05，▲P＜0.01

組別 5 min 10 min 15 min 20 min假手術(shù)組 0.20±0.08 0.19±0.06 0.17±0.05 0.18±0.05模型組 0.01±0.01?? 0.02±0.03?? 0.02±0.02?? 0.03±0.04??溶劑組 0.01±0.01?? 0.01±0.01?? 0.01±0.01?? 0.02±0.01??陽性藥組 0.08±0.06??▲ 0.11±0.11??▲▲ 0.09±0.13??▲ 0.07±0.10??▲蘇合香低劑量組 0.03±0.03?? 0.03±0.03?? 0.03±0.02?? 0.05±0.04??蘇合香中劑量組 0.08±0.08??▲ 0.07±0.06??▲ 0.07±0.06??▲ 0.08±0.07??▲▲蘇合香高劑量組 0.11±0.13??▲▲ 0.10±0.09??▲▲ 0.06±0.07?? 0.04±0.03??

3.2 蘇合香對LVEDP、LVAP的影響 表2～3顯示，與假手術(shù)組比較，模型組LVEDP、LVAP于10、15、20、 25 min顯著升高 （P＜0.05， P＜0.01）；與溶劑組比較，蘇合香低劑量組兩者于5、10、 15、 20、 25、 30 min顯著降低 （P＜0.01）， 中劑量組于5、10、15、20 min顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01）。

表2 蘇合香對LVEDP的影響 （±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）Tab.2 Effect of Styrax on LVEDP（±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）

表2 蘇合香對LVEDP的影響 （±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）Tab.2 Effect of Styrax on LVEDP（±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與溶劑組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別LVEDP／mmHg 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min假手術(shù)組 74.45±8.59 78.47±6.49 66.69±18.14 58.01±15.54 60.71±10.73 68.42±19.78 62.26±14.95 81.67±20.12模型組 93.54±15.68 99.90±12.36? 94.95±10.83? 100.88±19.30 95.04±6.51?? 70.65±49.48 76.50±54.7 74.37±53.12溶劑組 95.61±0.53?? 97.96±3.41?? 102.78±4.48? 100.38±8.97?? 101.75±3.53?? 100.02±3.07 87.67±14.16 94.49±13.12陽性藥組 66.17±7.91▲▲ 76.62±12.10▲ 80.21±14.09▲ 65.01±17.64▲ 68.31±16.56▲ 64.57±18.65 60.61±16.24 63.58±19.35蘇合香低劑量組 63.60±5.11▲▲ 73.03±7.55▲▲ 68.22±11.69▲▲ 71.23±5.42▲▲ 73.48±7.69▲▲ 75.92±7.88▲▲ 73.37±9.48 82.08±15.97蘇合香中劑量組 80.04±7.94▲ 81.57±9.52▲ 84.52±2.99▲▲ 85.25±6.11?▲ 90.28±7.62?? 87.28±11.84 102.41±15.22?? 98.07±16.59蘇合香高劑量組 85.96±7.59 81.56±13.25 78.28±15.77 80.25±18.01 79.48±18.71 72.42±30.01 74.55±18.82 74.73±28.65

表3 蘇合香對LVAP的影響 （±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）Tab.3 Effect of Styrax on LVAP（±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）

表3 蘇合香對LVAP的影響 （±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）Tab.3 Effect of Styrax on LVAP（±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與溶劑組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別LVAP／mmHg 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min假手術(shù)組 79.74±6.74 81.08±6.75 69.99±16.6 63.11±15.73 66.56±13.87 74.35±26.98 66.70±14.97 84.18±16.45模型組 95.26±11.7 100.76±10.67? 96.09±8.25? 100.36±17.30? 93.14±3.92?? 73.12±51.26 76.16±54.53 73.43±52.79溶劑組 89.14±12.3 96.81±4.29?? 98.15±8.21? 94.88±12.15? 97.09±9.30? 97.76±7.67 90.15±13.21 94.83±10.76陽性藥組 70.86±8.70▲ 76.48±10.58▲▲ 81.41±12.71 69.68±18.80 73.29±18.58▲ 69.99±20.64▲ 66.02±19.28 73.48±25.62蘇合香低劑量組 64.86±5.50??▲▲ 72.92±6.84▲▲ 69.81±10.92▲▲ 72.93±3.81▲▲ 74.44±6.20▲▲ 77.02±6.83▲▲ 74.55±8.77 81.38±13.58蘇合香中劑量組 80.56±7.13 86.42±9.07 82.22±4.45▲ 87.89±7.33 94.38±9.17? 92.87±8.40 106.08±18.63?100.87±12.65蘇合香高劑量組 69.11±46.65 90.68±21.36 84.89±18.83 85.17±17.60 83.87±17.90 78.36±27.38 56.88±41.80 67.66±27.39

3.3 蘇合香對心肌梗死面積百分比的影響 圖1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組心肌梗死率顯著增加 （P＜0.01）；與溶劑組比較，蘇合香低劑量組其梗死率顯著降低 （P＜0.01）。

3.4 心肌組織染色 表4、圖2顯示，與模型組、溶劑組比較，蘇合香組損傷面積 （紅色曲線范圍）和炎性細(xì)胞浸潤、變性壞死、出血程度均顯著改善（P＜0.05，P＜0.01），而且中劑量組還可顯著改善炎細(xì)胞浸潤 （P＜0.05）。

圖1 蘇合香對心肌梗死率的影響Fig.1 Effect of Styrax on myocardial infarction rate

3.5 蘇合香對CK-MB、AST、LDH活性的影響表5顯示，與假手術(shù)組比較，模型組 CK-MB、AST、LDH 活性顯著升高 （P＜0.05， P＜0.01）；與溶劑組比較，蘇合香低、高劑量組CK-MB活性顯著降低 （P＜0.05），低、中劑量組LDH活性顯著下降 （P＜0.05，P＜0.01），各劑量組AST活性顯著下降 （P＜0.05， P＜0.01）。

4 討論

心肌缺血是指心臟血液灌注及供氧減少，導(dǎo)致心肌代謝失常、心臟無法正常工作的一種病理狀態(tài)［6］，長期心肌缺血可發(fā)展為心肌梗死或猝死。現(xiàn)代藥理研究表明，蘇冰滴丸、冠心蘇合丸具有顯著抗心肌缺血作用［7-10］； 許福會［10］報道， 蘇合香可預(yù)防性改善24 h心梗大鼠心電ST段的抬高，減少大鼠心肌梗死率；但目前鮮有單味蘇合香改善心肌缺血的研究，故本實驗開展了初步探討。

表4 蘇合香對心肌組織的影響 （±s， n＝6）Tab.4 Effect of Styrax on myocardial tissues（±s， n＝6）

表4 蘇合香對心肌組織的影響 （±s， n＝6）Tab.4 Effect of Styrax on myocardial tissues（±s， n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與溶劑組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 炎癥細(xì)胞 水腫 出血 變性 壞死 總評分假手術(shù)組 0.00±0.00 0.00±0.00 0.17±0.41 0.17±0.41 0.17±0.41 0.50±0.55模型組 1.50±0.55?? 1.50±0.55?? 2.33±0.52?? 0.50±0.55▲ 3.50±0.55?? 9.33±1.37??溶劑組 1.50±0.84?? 2.17±0.98?? 2.00±0.89?? 1.83±1.33? 3.50±0.84?? 10.83±2.71??蘇合香低劑量組 1.00±0.00?? 0.00±0.00▲▲ 1.33±0.52?? 0.17±0.41▲▲ 2.67±0.82??▲ 5.17±0.75??▲▲蘇合香中劑量組 0.83±0.41??▲ 0.67±0.52▲▲ 1.33±0.82?? 0.50±0.55▲ 2.67±0.52??▲ 6.00±1.90??▲▲蘇合香高劑量組 1.50±0.55?? 1.00±0.89??▲▲ 1.33±0.52?? 1.00±1.55 2.33±0.82??▲▲ 7.17±3.06??▲▲

圖2 各組心肌組織HE染色Fig.2 HE staining of myocardial tissues in various groups

表5 蘇合香對CK-MB、LDH、AST活性的影響 （±s， n＝6）Tab.5 Effects of Styrax on CK-MB，LDH and AST activities（±s， n＝6）

表5 蘇合香對CK-MB、LDH、AST活性的影響 （±s， n＝6）Tab.5 Effects of Styrax on CK-MB，LDH and AST activities（±s， n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與溶劑組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別 CK-MB／（U·L－1） LDH／（U·L－1. ） AST／（U·L－1）假手術(shù)組 399.36±57 125.47±40.49 23.35±5.62模型組 667.75±100.07? 787.82±145.58?? 44.47±0.92?溶劑組 661.99±41.82? 900.63±276.43?? 49.60±7.78??陽性藥組 331.56±52.19▲▲ 521.61±245.53?? 23.57±4.90▲▲蘇合香低劑量組 435.08±83.62▲ 279.27±286.02▲▲ 26.75±8.60▲▲蘇合香中劑量組 678.55±98.99? 553.50±140.12??▲ 32.22±4.81▲蘇合香高劑量組 510.89±54.74▲ 810.82±347.37?? 11.79±2.85▲▲

大鼠結(jié)扎心臟冠狀動脈左前降支是造成心肌缺血損傷模型的常用方法之一［11］，它可致心臟供血不足，所引起的心肌缺血、梗死模型與人類心肌缺血梗死有相似病理生化和形態(tài)學(xué)改變，故本實驗采用該方法模擬大鼠心肌缺血，并以ST段為判定心肌缺血的重要指標(biāo)，當(dāng)其呈水平型、下斜型或上斜型下移，幅度大于0.05 mV時，可認(rèn)為心肌缺血［12-14］。結(jié)果顯示，模型組大鼠 ST段顯著下移（大于0.1 mV），提示造模成功，給予以5%吐溫時也無改善，而0.333、0.667 g／kg蘇合香可有效抑制其下移，提示它有改善心肌缺血作用。

左心室舒張末壓 （LVEDP）是評價左心功能的重要方法，心室收縮能力降低時，心室內(nèi)血液排出量減少，剩余血液增多，從而使其增加［15-18］。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型大鼠LVEDP顯著增高，提示左心室收縮，舒張功能障礙，而蘇合香則有效降低LVEDP，可能是它通過改善心臟收縮功能來改善心肌缺血。

當(dāng)心肌細(xì)胞缺氧時，細(xì)胞發(fā)生腫脹、胞質(zhì)透明、淡染，重者發(fā)生氣球樣變性，可使心肌收縮力量減弱，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致細(xì)胞壞死；當(dāng)炎癥發(fā)生時，壞死細(xì)胞及周圍可滲出中性粒細(xì)胞，加重壞死及局部實質(zhì)細(xì)胞溶解。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型大鼠心肌細(xì)胞呈水腫、壞死，并伴有出血及中性粒細(xì)胞浸潤，5%吐溫有加重心肌細(xì)胞變性趨勢，而蘇合香可有效抑制心肌細(xì)胞變性、壞死，改善損傷程度，從而保護(hù)心肌。

心肌梗死時，血清中肌酸激酶水平迅速提高，尤其是肌酸激酶同工酶 （CK-MB）診斷的特異性最高［19］。本實驗發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第3天模型組、溶劑組大鼠血清CK-MB水平顯著增高，而蘇合香能有效抑制，質(zhì)量濃度0.167 g／kg時改善最明顯，提示它可減緩心肌損傷程度；乳酸脫氫酶（LDH）、AST主要分布于心肌，心肌梗死時兩者活性升高，故也用于心肌疾病的診斷［20-21］，本實驗發(fā)現(xiàn)模型大鼠血清中兩者活性顯著增高，而蘇合香則能顯著抑制，也以質(zhì)量濃度0.167 g／kg時效果最佳。聚類分析見圖3，可知蘇合香低劑量組 （0.167 g／kg）抗心肌缺血作用最佳，其次是中劑量組 （0.333 g／kg）， 而高劑量組 （0.667 g／kg）較差，即療效與劑量呈負(fù)相關(guān)。

圖3 抗心肌缺血作用聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis diagram for anti-myocardial ischemia effect

綜上所述，蘇合香可通過改善心功能、減少心肌梗死面積、減緩心肌細(xì)胞壞死、降低心肌酶活性，從而有效防治大鼠心肌缺血損傷，并以低劑量組作用最佳。但本實驗僅對蘇合香抗心肌缺血的劑量及藥效進(jìn)行探討，今后將從PI3K／Akt通路方面開展研究，因其能參與調(diào)控心肌缺血相關(guān)凋亡因子（Caspase-3、 Caspase-9、 Bcl2、 Bax）、 相關(guān)擴血管因子表達(dá) （eNOS、VEGF等）、M1／M2型巨噬細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子和酶類，進(jìn)而修復(fù)損傷，改善心肌缺血和心肌梗死［22-25］，相關(guān)作用是否與調(diào)控該通路有關(guān)是有待解決的問題。