芪仙地花顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

張 蓓， 羅旭明， 李默影， 王雄彪， 吳 彤?

（1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院中藥創(chuàng)新中心，上海201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062）

芪仙地花顆粒來源于上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、淫羊藿、虎杖、巴戟天、枇杷葉、生地黃、川芎、旋覆花8味藥材組成，具有治療支氣管哮喘的作用［1-2］，該方傳統(tǒng)劑型為湯劑，不易貯存及攜帶，故將其改進(jìn)成顆粒劑，克服了湯劑不足，而且穩(wěn)定、易攜帶［3］，但至今尚無其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方中淫羊藿補(bǔ)腎溫陽，止咳平喘，而黃芪入肺補(bǔ)肺氣，入脾補(bǔ)益中土，杜絕生痰之源，兩者共為君藥，具有抗炎、抗哮喘作用［4-6］；虎杖活血散瘀，巴戟天補(bǔ)腎助陽，共為臣藥。藥理研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷通過調(diào)節(jié)前列腺素D2水平來改善哮喘小鼠癥狀；虎杖苷可減少免疫性刺激物引起的ROS產(chǎn)生，從而防止CRAC通道激活造成的細(xì)胞外Ca2＋內(nèi)流，抑制肥大細(xì)胞脫顆粒，最終對OVA誘導(dǎo)的過敏性哮喘產(chǎn)生治療作用［7-8］；從黃芪中分離得到的黃芪甲苷具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化活性；巴戟天具有抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效［9-10］，故本實(shí)驗(yàn)采用TLC、HPLC法分別定性鑒別黃芪、巴戟天，HPLC法測定淫羊藿苷、虎杖苷含有量，可為芪仙地花顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀 （美國Water公司）；Milli-Q超純水機(jī) （美國密理博公司）；MS105DU半微量天平 （萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；DK-S24電熱恒溫水浴鍋 （上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司）；SK250HP超聲波清洗器（250 W、53 kHz，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Hei-VAP Value旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （德國海道爾夫集團(tuán)）。

1.2 試藥 芪仙地花顆粒 （12 g／袋， 批號1610001、1611001、1612001）由上海寶龍藥業(yè)有限公司提供。缺黃芪、巴戟天陰性樣品為自制。淫羊藿苷 （批號 110737-201516）、 虎杖苷 （批號111575-200502）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；黃芪甲苷 （批號 3823）、 耐斯糖 （批號4383）對照品購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司。HSGF254硅膠板 （煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）。乙腈，甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 定性鑒別

2.1 黃芪 取本品約10 g，加100 mL甲醇加熱回流1 h，過濾，濾液濃縮至干，加20 mL水溶解，加水飽和正丁醇溶液振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，60 mL氨試液充分洗滌，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液；取陰性樣品10 g，同法制成相應(yīng)溶液；取黃芪甲苷對照品適量，甲醇制成0.1 mg／mL對照品溶液。按照2015版 《中國藥典》四部通則0502薄層色譜法，吸取上述3種溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水 （13∶7∶2）下層溶液為展開劑，展開，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰［11］，結(jié)果見圖1。由圖可知，供試品色譜中與對照品相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性無干擾。

圖1 黃芪TLC色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Astragali Radix

2.2 巴戟天 取本品約3 g，加3%甲醇50 mL，超聲30 min（250 W、53 kHz），濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?%甲醇5 mL溶解，作為供試品溶液；取陰性樣品3 g，同法制成相應(yīng)溶液；取耐斯糖對照品適量，3%甲醇制成0.1 mg／mL對照品溶液。按照2015版 《中國藥典》附錄ⅥD高效液相色譜法，分析條件為Waters XTerra C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相甲醇-水， 等度洗脫（3∶97）； 體積流量 1 mL／min； 蒸發(fā)光散射檢測器［12］，色譜圖見圖2。由圖可知，供試品呈現(xiàn)與對照品保留時(shí)間一致的色譜峰，陰性無干擾，理論塔板數(shù)按耐斯糖計(jì)應(yīng)不低于2 000。

圖2 耐斯糖HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of nystose

3 HPLC含有量測定

3.1 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Waters XTerra C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相水（A）-乙腈 （B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1 mL／min；柱溫30℃；檢測波長306 nm。理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于3 000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

3.2 對照品溶液制備 精密稱取淫羊藿苷、虎杖苷對照品適量，置于棕色量瓶中，50%甲醇制成分別含兩者10、40 μg／mL的溶液，即得。

3.3 供試品溶液制備 精密稱取本品粉末1 g，置于25 mL量瓶中，50%甲醇溶解定容，密塞，超聲30 min（250 W、53 kHz），放冷，搖勻，濾過，精密移取續(xù)濾液1 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，即得。

3.4 陰性樣品溶液的制備 精密稱取缺虎杖、缺淫羊藿的陰性樣品各1 g，按 “3.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

3.5 專屬性試驗(yàn) 取 “3.2” ～ “3.4” 項(xiàng)下溶液各20 μL，在 “3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖3。由圖可知，對照品色譜峰分離度良好，陰性無干擾。

圖3 各成分HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

3.6 檢測限、定量限考察 精密稱取淫羊藿苷對照品適量，置于棕色量瓶中，50%甲醇制成0.509 mg／mL對照品溶液；精密稱取虎杖苷對照品適量，置于棕色量瓶中，50%甲醇制成0.54 mg／mL對照品溶液，將 2種溶液成倍稀釋，以信噪比 （S／N） ＝3為檢測限，S／N＝10為定量限。結(jié)果，淫羊藿苷檢測限、定量限分別為1.53、4.58 ng，虎杖苷分別為0.54、1.62 ng。

3.7 線性關(guān)系考察 取 “3.6”項(xiàng)下淫羊藿苷對照品溶液，50%甲醇稀釋成25.45、12.73、5.09、2.55、 1.27、 0.51 μg／mL； 取 “3.6” 項(xiàng)下虎杖苷對照品溶液，50%甲醇稀釋成 27.00、13.50、5.40、 2.70、 1.35、 0.54 μg／mL， 在 “3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸，得淫羊藿苷、虎杖苷方程分別為Y＝0.272X＋0.003（r＝1）、Y＝0.888 6X－0.041 8 （r＝1）， 在 0.51～25.45、0.54～ 27.00 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.8 精密度試驗(yàn) 對照品溶液在 “3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得淫羊藿苷、虎杖苷峰面積RSD分別為1.58%、0.17%，表明儀器精密度良好。

3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品6份，按 “3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得淫羊藿苷、虎杖苷含有量RSD分別為4.65%、4.31%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取本品1 g，按 “3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、4、8、12、24 h在 “3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得淫羊藿苷、虎杖苷峰面積RSD分別為1.02%、1.10%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.11 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的本品，加入適量對照品溶液，按 “3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

3.12 樣品含有量測定 按 “3.3”項(xiàng)下方法制備 供試品溶液，測定含有量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含有量測定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of various constituents

4 討論

在巴戟天定性鑒別過程中，首先通過TLC法考察蒽醌類成分，但芪仙地花顆粒中虎杖也含有該類成分，陰性樣品可能有干擾。由于耐斯糖是巴戟天特征成分，故對其進(jìn)行鑒別，同時(shí)由于糖類化合物極性較大，在薄層層析板上成點(diǎn)性不理想，故選擇HPLC-ELSD法。

前期課題組選擇甲醇、50%甲醇、水提取制備供試品溶液，發(fā)現(xiàn)50%甲醇提取率高，雜質(zhì)少。對虎杖苷、淫羊藿苷對照品進(jìn)行全波長掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者分別在318、270 nm處有最大吸收，綜合考慮紫外吸收靈敏度，最終選擇306 nm作為檢測波長。

另外，批號1610001的芪仙地花顆粒在制備工藝中所用的虎杖、淫羊藿與批號 1611001、1612001的不同，故淫羊藿苷、虎杖苷含有量也存在差異。