一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定參芪二仙片中9種成分

蔡楚蘭， 廖 勇

（1.宜昌市優(yōu)撫醫(yī)院科教科，湖北宜昌443005；2.三峽大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院，湖北 宜昌443001）

參芪二仙片收載于中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn) （中藥成方制劑第二十冊(cè)）［1］，由淫羊藿、酒制仙茅、鹽制巴戟天、紅參、黃芪、當(dāng)歸、鹽制黃柏、鹽制知母8味藥材組成，具有補(bǔ)腎填精、調(diào)補(bǔ)沖任、益氣養(yǎng)血的功效，臨床上主要用于治療腎虛腰膝酸軟、陽(yáng)痿早泄、遺精、更年期經(jīng)血不調(diào)等癥，但其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)方中成分進(jìn)行定量測(cè)定， 僅趙玉華［2］、 楊國(guó)振［3］等采用 HPLC 法測(cè)定淫羊藿苷含有量，難以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性和臨床療效一致性。因此，本實(shí)驗(yàn)采用一測(cè)多評(píng)法，以參芪二仙片中淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其與仙茅苷、仙茅苷乙、水晶蘭苷、去乙?；嚾~草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷Ⅰ的相對(duì)校正因子，測(cè)定各成分含有量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀 （美國(guó)安捷倫公司）；BP211D型電子分析天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ2200型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）。參芪二仙片 （批號(hào)161002、161103、170107），購(gòu)于沈陽(yáng)紅藥集團(tuán)股份有限公司。仙茅苷 （110771-201707）、水晶蘭苷 （111870-201303）、朝藿定 C （111780-201503）、淫羊藿苷 （110737-201516）、寶藿苷Ⅰ （111852-201603）對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；仙茅苷乙 （143601-09-6）對(duì)照品購(gòu)于深圳市佰森生物技術(shù)有限公司；去乙?；嚾~草苷酸 （14259-55-3）、朝藿定 A （110623-72-8）、朝藿定B（110623-73-9）對(duì)照品購(gòu)于上海純優(yōu)生物科技有限公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈 （A） -0.1% 冰醋酸（B）， 梯度洗脫 （0～16 min， 10.0%A； 16～34 min，10.0%→21.0%A；34～47 min，21.0%→26.0%A；47～58 min，26.0% → 45.0%A；58～65 min，45.0%→10.0%A）； 0～23 min 時(shí)在280 nm［4］波長(zhǎng)下檢測(cè)仙茅苷和仙茅苷乙，23～34 min時(shí)在235 nm［5-6］波長(zhǎng)下檢測(cè)水晶蘭苷和去乙?；嚾~草苷酸，34～65 min 時(shí)在 270 nm［2-3，7-11］波長(zhǎng)下檢測(cè)朝藿定 A、 朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ；體積流量0.9 mL／min； 柱溫30℃； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 取片劑10片，除去糖衣后研細(xì)，精密稱取細(xì)粉約0.4 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入 70%乙醇 50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（100 W、40 kHz）30 min，放冷，70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取仙茅苷、仙茅苷乙、水晶蘭苷、去乙?；嚾~草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ對(duì)照品適量，70%乙醇制成質(zhì)量濃度分別為0.432、0.176、0.814、 0.498、 0.262、 0.556、 1.038、 0.642、0.416 mg／mL的貯備液，各精密吸取2.5 mL，置于50 mL量瓶中，70%乙醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為21.6、8.8、40.7、24.9、 13.1、27.8、51.9、 32.1、 20.8 μg／mL 的溶液， 即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按片劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的處方和工藝，分別制成不含仙茅、巴戟天、淫羊藿的陰性樣品，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性考察與專屬性試驗(yàn) 精密吸取供試品、對(duì)照品、陰性樣品溶液適量，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖可知，各成分與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各色譜峰計(jì)均大于3 500，陰性無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各 2.0 mL，置于同一20 mL量瓶中，70%乙醇定容至刻度，搖勻，作為混標(biāo)液A，精密吸取適量，70%乙醇分別稀釋 2、4、8、16、20倍，作為混標(biāo)液B、C、D、E、F，精密吸取適量，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 方法學(xué)考察

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取 “2.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)樣6 d，每天1次，考察日間精密度。結(jié)果，仙茅苷、仙茅苷乙、水晶蘭苷、去乙?；嚾~草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ日內(nèi)峰面積RSD分別為 0.91%、1.13%、0.66%、0.80%、1.09%、0.87%、0.59%、0.64%、0.93%，日間峰面積 RSD分別為 1.08%、1.27%、0.74%、0.85%、1.03%、0.99%、0.57%、0.72%、1.01%，表明該方法精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批片劑，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得仙茅苷、仙茅苷乙、水晶蘭苷、去乙?；嚾~草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ含有量RSD分別為 0.32%、 1.54%、 1.16%、 1.23%、 0.49%、1.30%、1.01%、0.76%、1.36%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批片劑，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、12 h在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得仙茅苷、仙茅苷乙、水晶蘭苷、去乙?；嚾~草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ峰面積 RSD分別為 0.88%、1.15%、0.69%、 0.74%、 1.06%、 0.85%、 0.57%、0.62%、1.09%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的片劑適量，除去糖衣后研細(xì)，精密稱取細(xì)粉6份，每份約0.2 g，置于 50 mL量瓶中，精密加入仙茅苷（0.257 mg／mL）、 仙茅苷乙 （0.098 mg／mL）、 水晶蘭苷 （0.553 mg／mL）、去乙?；嚾~草苷酸（0.287 mg／mL）、 朝藿定 A （0.151 mg／mL）、 朝藿定 B （0.331 mg／mL）、 淫羊藿苷 （0.394 mg／mL）、寶藿苷Ⅰ （0.227 mg／mL） 對(duì)照品溶液各1.0 mL，以及朝藿定 C（0.353 mg／mL）對(duì)照品溶液2.0 mL，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，仙茅苷、仙茅苷乙、水晶蘭苷、去乙?；嚾~草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ平均加樣回收率分別為98.63%、97.13%、99.41%、98.38%、97.46%、98.49%、100.05%、 99.19%、 97.70%， RSD 分別為1.18%、 1.44%、 0.86%、 1.25%、 1.52%、0.94%、0.85%、1.03%、1.32%。

2.6 相對(duì)校正因子計(jì)算 精密吸取 “2.4”項(xiàng)下混標(biāo)液適量，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他8種成分相對(duì)校正因子 fk／s， 公式為 fk／s＝fk／fs＝ （WkAs） ／（WsAk） （Wk為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度，Ak為內(nèi)標(biāo)峰面積，Ws為其他成分質(zhì)量濃度，As為其他成分峰面積），結(jié)果見表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.7 各因素對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.7.1 儀器、色譜柱 取 “2.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，考察Agilent 1100、LC-20AT色譜儀和 Kromasil C18、Agilent TC-C18、Diamonsil C18色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表3，可知均無明顯影響。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.7.2 體積流量 取 “2.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，考察體積流量0.8、0.9、1.0 mL／min對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表4，可知均無明顯影響。

表4 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effects of different volume flow rates on relative correction factors

2.7.3 柱溫 取 “2.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，考察柱溫25、30、35℃對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表5，可知均無明顯影響。

表5 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.8 色譜峰定位 本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)保留值法對(duì)待測(cè)成分色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果見表6，可知不同儀器、色譜柱下各成分相對(duì)保留值無明顯差異。

表6 各成分相對(duì)保留值Tab.6 Relative retention values of various constituents

2.9 樣品含有量測(cè)定 取3批片劑 （批號(hào)161002、161103、 170107） 適量， 按 “2.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表7，可知2種方法所得結(jié)果無明顯差異，相對(duì)平均偏差 （RAD）均＜2%。

表7 各成分含有量測(cè)定結(jié)果 （mg／g）Tab.7 Results of content determination of various constituents （mg／g）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑 （50% 乙醇［2-3，7，9-12］、 70% 乙醇［5，13］、 乙醇、50% 甲醇、 甲醇［4，10］）、 提取方式 （超聲［2，5，7，9-10］、加熱回流［3-4，8］） 對(duì)待測(cè)成分提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)以70%乙醇為提取溶劑時(shí)綜合提取效率最佳，而超聲、加熱回流提取所得結(jié)果差異不大，但前者更方便穩(wěn)定。然后，又考察了提取時(shí)間 （15、30、60 min）對(duì)提取效率的影響，同時(shí)對(duì)超聲功率、頻率也進(jìn)行了不斷摸索。最終確定，供試品溶液制備方法為以70%乙醇為提取溶劑，超聲 （100 W、40 kHz） 30 min。

3.2 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)以待測(cè)成分峰形及分離效果、色譜圖基線平穩(wěn)情況、出峰時(shí)間為指標(biāo)，考察了 乙腈-水［2-3，7，9-11，13］、 甲 醇-0.1% 磷 酸［5，10］、 乙腈-0.1%冰醋酸流動(dòng)相體系［4，8］， 并對(duì)流動(dòng)相洗脫比例進(jìn)行了不斷摸索。最終確定，以乙腈-0.1%冰醋酸為流動(dòng)相，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下梯度洗脫。

4 結(jié)論

中成藥復(fù)方制劑具有多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，單一成分難以實(shí)現(xiàn)對(duì)其整體質(zhì)量的評(píng)價(jià)和控制，故多指標(biāo)質(zhì)量控制已成為的必然趨勢(shì)，但它又存在對(duì)照品使用量大、單體不穩(wěn)定或價(jià)格昂貴、檢驗(yàn)成本高等問題。一測(cè)多評(píng)法根據(jù)中藥不同有效成分之間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例，通過測(cè)定某1種性質(zhì)穩(wěn)定、對(duì)照品價(jià)廉的成分來實(shí)現(xiàn)多種成分的同步測(cè)定，可大大降低檢驗(yàn)成本，提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)采用該方法同時(shí)測(cè)定參芪二仙片中仙茅苷、仙茅苷乙、水晶蘭苷、去乙?；嚾~草苷酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ的含有量，所建立的相對(duì)校正因子可信度較高，而且該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，可為提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供有力的數(shù)據(jù)支持。