大孔吸附樹脂純化紫菀總黃酮工藝

李園園， 李洪娟， 侯桂革， 趙 峰， 叢 蔚， 辛文妤， 郝聚偉， 王春華

（濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東煙臺264003）

紫菀是菊科紫菀屬植物紫菀Aster tataricus L.f.的干燥根和根莖，功效潤肺下氣、化痰止咳，臨床上常用于治療痰多咳喘、痰中帶血、新久咳嗽等癥狀［1-4］。研究表明，紫菀中鎮(zhèn)咳祛痰的藥效物質(zhì)包括紫菀酮、木栓醇等三萜皂苷類，以及槲皮素、木犀草素、橙皮苷、山柰酚、芹菜素等黃酮類［5-6］。

近年來，關(guān)于紫菀提取物藥理活性的研究較多，但鮮有總黃酮純化工藝的報(bào)道。大孔吸附樹脂是一種高分子吸附材料，具有價(jià)廉、吸附性能好、能反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于中藥及復(fù)方中化學(xué)成分的分離與精制［7-13］。本實(shí)驗(yàn)探討紫菀總黃酮的大孔吸附樹脂純化工藝，為該成分進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

QYC-200恒溫振蕩器 （上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 （鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；722N紫外-可見分光光度計(jì) （上海儀電分析儀器有限公司）；KQ-400DB數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；EL204電子天平 ［梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司］。

紫菀提取物 （自制，總黃酮含有量2.62%）；蘆丁對照品 （含有量大于98%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；D101-I型大孔吸附樹脂購于鄭州勤實(shí)科技有限公司；HPD-300、HPD-450、HPD-600、HPD-826型大孔吸附樹脂購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司；NKA-9型大孔吸附樹脂購于天津南開和成科技有限公司，物理參數(shù)見表1。

表1 大孔吸附樹脂物理參數(shù)Tab.1 Physical parameters for macroporous absorption resins

2 方法

2.1 總黃酮含有量測定 參照文獻(xiàn) ［14］方法并進(jìn)行修正，以蘆丁為對照品，紫外分光光度法測定總黃酮含有量。

2.1.1 線性關(guān)系考察 精密稱取干燥后的蘆丁對照品適量，60%甲醇溶解定容于25 mL量瓶中，精密吸取適量置于25 mL量瓶中，加入蒸餾水至6 mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，接著加入10%硝酸鋁溶液 1 mL，充分搖勻后靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，定容，搖勻，靜置15 min，于510 nm波長處測定吸光度。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），吸光度為縱坐標(biāo) （A）進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.012 7X－0.023 4 （R2＝0.999 6）， 在 12.61～75.65 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱取提取物5份，每份2.0 g，加入50 mL蒸餾水超聲溶解，過濾，即得。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0 mL，按 “2.1.1”項(xiàng)下方法測定吸光度5次，測得其RSD為1.17%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0 mL，按 “2.1.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，測得其RSD為0.87%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0 mL，按 “2.1.1” 項(xiàng)下方法于0、15、30、45、60、90、120、180 min測定吸光度，測得其 RSD為1.44%，表明溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取含有量已知的供試品溶液6份，每份1.0 mL，精密加入蘆丁對照品溶液0.5 mL，按 “2.1.1”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果，蘆丁平均加樣回收率為98.03%，RSD為1.33%。

2.2 靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn) 將預(yù)處理好的樹脂濾干表面水分后稱取2.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入提取物溶液，于恒溫振蕩器中連續(xù)振搖12 h（25℃、150 r／min），吸附完成后過濾，測定總黃酮質(zhì)量濃度，按照公式計(jì)算樹脂吸附量。吸附飽和后的樹脂，先用蒸餾水100 mL洗除表面樣品，再加入80%乙醇50 mL，恒溫振蕩器中振搖進(jìn)行解吸，條件同上，解吸完成后過濾，測定解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度，按照公式計(jì)算樹脂解吸量和解吸率。其中，Qe為樹脂吸附量，C0、Ce分別為吸附前、后吸附液中總黃酮質(zhì)量濃度，V0為吸附液體積，W為樹脂質(zhì)量，Qd為樹脂解吸量，D為解吸率，Cd為解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度，Vd為解吸液體積。

2.3 吸附動力學(xué)實(shí)驗(yàn) 稱取HPD-300樹脂2.0 g，按 “2.2”項(xiàng)下方法吸附，在不同吸附時(shí)間取樣，測定總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附量，以吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)繪制吸附動力學(xué)曲線，用準(zhǔn)一級、準(zhǔn)二級動力學(xué)模型和顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，公式分別為 ln（Qe－Qt）＝lnQe－其中，Qt、Qe分別為在吸附時(shí)間t、平衡時(shí)總黃酮吸附量，K1、K2、Ki分別為準(zhǔn)一級、準(zhǔn)二級動力學(xué)模型和顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型速率常數(shù)；C為顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型常數(shù)。

2.4 吸附等溫線實(shí)驗(yàn) 稱取HPD-300樹脂2.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入不同質(zhì)量濃度提取物溶液50 mL，在25～45℃下于恒溫振蕩器中振搖吸附，吸附完成后測定總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附量，繪制吸附等溫線，通過Langmuir、Freundlich吸附等溫模型進(jìn)行擬合，公式分別為。其中， Q為樹脂max最大量，KL為 Langmuir常數(shù)，KF為Freundlich常數(shù)，1／n為吸附指數(shù)。

2.5 動態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn) 稱取HPD-300樹脂3份，每份15 g，濕法裝入3根色譜柱中，取40、60、80 mg／mL提取物溶液，以2 BV／h體積流量上樣，每1 BV收集1份流出液，測定總黃酮質(zhì)量濃度，繪制泄漏曲線。然后，吸附飽和后的樹脂柱，先用5 BV蒸餾水洗脫未吸附的樣品及雜質(zhì)，再依次用10%、50%、70%乙醇和純乙醇各5 BV洗脫，每1 BV收集1份洗脫液，測定總黃酮質(zhì)量濃度，繪制洗脫曲線。

3 結(jié)果

3.1 靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn) 圖1顯示，HPD-300、D101-I樹脂為非極性樹脂，HPD-600、NKA-9樹脂為極性樹脂，均對總黃酮具有較好的吸附效果，其中HPD-300樹脂吸附能力最強(qiáng)，可能與它有較大的比表面積，能提供更多吸附位點(diǎn)有關(guān)，而且解吸能力也最強(qiáng)，故選擇其用于分離。

圖1 靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of static absorption／desorption tests

3.2 吸附動力學(xué)實(shí)驗(yàn) 圖2A顯示，隨著吸附時(shí)間延長總黃酮吸附量不斷增加，在0～120 min上升幅度較大，可能是由于開始時(shí)樹脂表面活性吸附位點(diǎn)較多，吸附速率較快，之后逐漸減少，黃酮從樹脂表面進(jìn)入樹脂內(nèi)部孔徑時(shí)受到一定阻力，吸附速率開始減慢，約在240 min左右達(dá)到平衡。圖2B顯示，顆粒內(nèi)擴(kuò)散呈現(xiàn)多線性階段，而且擬合曲線沒有通過原點(diǎn)，表明吸附速率是由液膜擴(kuò)散和顆粒內(nèi)擴(kuò)散步驟共同控制。

圖2 吸附動力學(xué)曲線 （A）和顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型擬合曲線 （B）Fig.2 Kinetic curve for absorption （A） and fitting curve for intraparticle diffusion model（B）

然后，通過準(zhǔn)一級、準(zhǔn)二級動力學(xué)模型進(jìn)行擬合，結(jié)果見表2。由表可知，總黃酮吸附更符合準(zhǔn)二級動力學(xué)模型。

表2 總黃酮吸附動力學(xué)參數(shù)Tab.2 Absorption kinetics parameters for total flavonoids

3.3 吸附等溫線實(shí)驗(yàn) 圖3顯示，吸附溫度為25℃時(shí)總黃酮吸附量最高，45℃時(shí)最低，表明低溫有利于吸附，即為放熱過程；同一溫度下隨著質(zhì)量濃度升高，總黃酮吸附量逐漸增加，說明樣品質(zhì)量濃度對樹脂吸附能力也有較大影響。

圖3 總黃酮吸附等溫線Fig.3 Absorption isotherms for total flavonoids

然后，通過Langmuir、Freundlich吸附等溫模型進(jìn)行擬合，結(jié)果見表3。由表可知，總黃酮吸附同時(shí)符合2種模型，表明可能為單分子層吸附；在Freundlich模型中，n＞l時(shí)為優(yōu)惠吸附，n＜l時(shí)為非優(yōu)惠吸附，而本實(shí)驗(yàn)中所有n均＞l，表明該成分吸附為優(yōu)惠吸附。

3.4 泄漏曲線 一般認(rèn)為，當(dāng)流出液中總黃酮濃度達(dá)到上樣液中其濃度的1／10時(shí)，即達(dá)到泄漏點(diǎn)。圖4顯示，提取物質(zhì)量濃度為40 mg／mL時(shí)，總黃酮在樹脂上的泄漏點(diǎn)為11 BV；為60 mg／mL時(shí)，泄漏點(diǎn)為8 BV；為80 mg／mL時(shí)，泄漏點(diǎn)為3 BV，但此時(shí)總黃酮溶解性變差。為了節(jié)省上樣時(shí)間，提高樹脂利用率，并避免樣品溶液浪費(fèi)，選擇60 mg／mL作為上樣質(zhì)量濃度，上樣體積7 BV。

表3 總黃酮吸附等溫參數(shù)Tab.3 Absorption isothermal parameters for total flavonoids

圖4 總黃酮泄漏曲線Fig.4 Leakage curves for total flavonoids

3.5 洗脫曲線 吸附飽和后的HPD-300樹脂，先用5 BV蒸餾水洗脫未吸附樣品和部分水溶性雜質(zhì)，再用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫，以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，洗脫液中總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線，見圖5。由圖可知，30%、70%乙醇及純乙醇洗脫液中總黃酮質(zhì)量濃度很低，無法破壞樹脂和其之間的吸附作用力，該成分主要集中在50%乙醇洗脫液中，表明其洗脫能力較強(qiáng)。為了節(jié)省溶劑，提高總黃酮純度，選擇50%乙醇作為洗脫溶劑，上樣體積5 BV。

圖5 總黃酮洗脫曲線Fig.5 Elution curves for total flavonoids

3.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 將7 BV提取物溶液 （60 mg／mL）上樣到HPD-300樹脂柱上吸附，吸附完成后先用5 BV蒸餾水洗脫雜質(zhì)，再用5 BV50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓蒸餾回收溶劑得純化產(chǎn)物，測定總黃酮含有量。結(jié)果，該成分含有量由2.62%提高到40.01%，較純化前提高了 15倍，收率為81.25%，表明HPD-300樹脂純化效果良好，可將其他非黃酮類雜質(zhì)除去。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)顯示，HPD-300型大孔吸附樹脂具有最大比表面積，表現(xiàn)出較好的吸附性能；紫菀總黃酮吸附過程符合準(zhǔn)二級動力學(xué)方程，由液膜擴(kuò)散和顆粒內(nèi)擴(kuò)散步驟共同控制；低溫有利于吸附，為放熱反應(yīng)；吸附既符合Langmuir模型，又符合Freundlich模型，可能為單分子層吸附和優(yōu)惠吸附；最佳條件為上樣質(zhì)量濃度60 mg／mL，上樣體積7 BV，先用5 BV蒸餾水沖洗雜質(zhì)，再用5 BV 50%乙醇洗脫，純化后總黃酮純度由2.62%提高到40.01%，收率為81.25%。

綜上所述，該方法合理有效，在節(jié)省時(shí)間和溶劑的同時(shí)可獲得高純度紫菀總黃酮，適合該成分的規(guī)?；苽?。