運動通過Parkin抗凋亡通路 抑制AD小鼠海馬細胞凋亡

畢 超, 呂 康, 何 標(biāo)

(安徽師范大學(xué) 體育學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

細胞凋亡(Apoptosis)是指機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、受凋亡基因調(diào)控的細胞有序死亡的現(xiàn)象，細胞凋亡受一系列凋亡相關(guān)基因的精確控制，如Caspase蛋白家族、Bcl-2蛋白家族、TNF蛋白家族、細胞色素C(Cytochrome C，cyt-c)等蛋白家族，調(diào)控細胞凋亡的基因相互作用形成細胞凋亡信號傳導(dǎo)通路，主要有死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡、線粒體通路介導(dǎo)的細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路介導(dǎo)的細胞凋亡三條通路。細胞凋亡對維持機體正常發(fā)育和自身穩(wěn)態(tài)具有重要意義。而細胞凋亡異常將導(dǎo)致腫瘤、帕金森綜合征及阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生。

阿爾茨海默病(AD)是一種進行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，多發(fā)于中老年人群，以記憶力減退和認(rèn)知功能障礙為主要臨床特征，以神經(jīng)纖維纏結(jié)、老年斑和突觸丟失為主要病理特征[1]。細胞凋亡導(dǎo)致AD海馬神經(jīng)元大量丟失，最終影響海馬的學(xué)習(xí)記憶功能。積極的身體活動作為一種干預(yù)手段能夠有效緩解AD的發(fā)生，有研究證實長期中等強度的跑臺運動顯著抑制NSE/APP轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬Caspase-3、Caspase-9和Bax等促細胞凋亡基因的表達，提高抑制細胞凋亡基因Bcl-2的表達水平，提高NSE/APP轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)細胞抗凋亡能力。但運動是如何調(diào)控細胞凋亡相關(guān)基因抑制轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)細胞的凋亡尚不清楚。而Parkin-NEMO-OPA1通路具有抑制細胞凋亡的能力，運動是否通過調(diào)控Parkin-NEMO-OPA1通路抑制海馬神經(jīng)細胞凋亡？受上述啟示，本研究探討運動調(diào)控Parkin-NEMO-OPA1信號通路對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的影響及機制。

1 實驗材料及方法

1.1動物及分組

選購3月齡雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠12只(南京大學(xué)模式動物研究所)，許可證號：SCXK(蘇2015—0001)。將APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為轉(zhuǎn)基因運動組(TE,N=6)和轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M(TC,N=6)，選取同系野生型小鼠作為正常對照組(C,N=6)。實驗動物置于標(biāo)準(zhǔn)動物房分籠飼養(yǎng)。

1.2 運動干預(yù)方案

實驗小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，TE組小鼠進行1周的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練。適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后對TE組小鼠進行運動干預(yù)。參照文獻[2]中運動強度，以小鼠最大攝氧量45%-55%的強度對TE組小鼠進行10周的跑臺運動，每周5次，每次訓(xùn)練持續(xù)時間為45min，運動結(jié)束后小鼠為7月齡。

1.3 取 材

TE組小鼠末次運動后，對所有實驗小鼠禁食12小時，脫頸處死，分離海馬，低溫保存，待測。

1.4 實時熒光定量(RT-PCR)測試

采用RT-PCR檢測方法對Parkin、NEMO、OPA1、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、cyt-c mRNA的表達水平進行檢測，用Trizol法提取小鼠海馬內(nèi)總的RNA，以20μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系得到穩(wěn)定的cDNA。實驗操作步驟按照文獻[3]進行。按要求設(shè)計合成引物(由上海生工生物有限公司合成)，引物序列見表1。按照RT-PCR擴增循環(huán)參數(shù)，以20μL體系進行RT-PCR實驗，記錄Ct值。根據(jù)2-△△Ct法計算相對表達量。所用儀器為(Thermo Fisher Scientific，美國，型號A28132)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠海馬細胞凋亡基因表達水平

本文采用RT-PCR技術(shù)檢測各組小鼠海馬Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、cyt-c mRNA的表達情況，如表2所示：與C組相比較，TC組小鼠海馬Caspase-3mRNA的表達水平升高，差異具有極顯著性(p<0.01)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬Caspase-3mRNA的表達水平下降，差異具有極顯著性(p<0.01)。與C組相比較，TC組小鼠海馬Caspase-6mRNA表達水平升高，差異具有顯著性(p<0.05)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬Caspase-6mRNA的表達水平下降，差異具有顯著性(p<0.05)。與C組相比較，TC組小鼠海馬Caspase-8mRNA的表達水平升高，差異具有極顯著性(p<0.01)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬Caspase-8mRNA的表達水平下降，差異具有顯著性(p<0.05)。與C組相比較，TC組小鼠海馬cyt-cmRNA表達水平升高，差異具有顯著性(p<0.05)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬cyt-cmRNA的表達水平下降，差異具有顯著性(p<0.05)(如圖1所示)。

表1 引物序列一覽表Table 1 Primer sequence of gene

表2 各組小鼠Caspase-3，Caspase-6，Caspase-8，cyt-c相對于GAPDH的mRNA表達水平

與C組相比，*p<0.05,**p<0.01，與TC組相比，△p<0.05,△△p<0.01

2.2 各組小鼠海馬Parkin抗凋亡通路基因表達水平

為研究運動對Parkin-NEMO-OPA1抗細胞凋亡通路的影響，運用RT-PCR技術(shù)檢測了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達情況，如表3所示，與C組相比較，TC組小鼠海馬Parkin mRNA的表達水平下降，差異具有顯著性(p<0.05)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬Parkin mRNA的表達水平升高，差異具有顯著性(p<0.05)。與C組相比較，TC組小鼠海馬OPA1mRNA的表達水平下降，差異具有顯著性(p<0.05)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬OPA1mRNA的表達水平升高，差異具有顯著性(p<0.05)。與C組相比較，TC組小鼠海馬NEMO mRNA表達水平升高，差異具有顯著性(p<0.05)，與TC組相比較，TE組小鼠海馬NEMO mRNA的表達水平升高，差異具有顯著性(p<0.05)(如圖2所示)。

表3 各組小鼠Parkin，NEMO， OPA1相對于GAPDH的mRNA表達水平

與C組相比，*p<0.05,與TC組相比，△p<0.05

3 討 論

細胞凋亡是真核細胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而啟動的內(nèi)部死亡機制，凋亡信號傳導(dǎo)通路精密調(diào)控機體的細胞凋亡，其中線粒體通路介導(dǎo)的細胞凋亡最為經(jīng)典[4]。Caspase家族對細胞凋亡起著關(guān)鍵性作用，是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵酶，Caspase有多個亞型，其中Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7是細胞凋亡的執(zhí)行者，而Caspase-8和Caspase-9則是細胞凋亡的啟動者。不同的細胞凋亡信號通路相互作用，激活Caspase-3和Caspase-6，誘發(fā)細胞凋亡[5]。神經(jīng)元細胞過度凋亡進一步降低了神經(jīng)元的存活，影響大腦功能，而AD腦內(nèi)神經(jīng)細胞大量丟失則是神經(jīng)細胞過度凋亡的結(jié)果。AD的發(fā)病與Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡密切相關(guān)，淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)的過度表達、持續(xù)的氧化應(yīng)激和腦損傷均可導(dǎo)致細胞凋亡的增多。

本研究發(fā)現(xiàn)，7月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Caspase-3、Caspase-6、cyt-c、Caspase-8mRNA表達均顯著高于正常對照組，提示APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬細胞凋亡增加。神經(jīng)細胞凋亡始于AD早期，甚至早于老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成之前。AD患者海馬Aβ含量增加，Aβ通過激活Caspase誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡，而Caspase-3又參與了APP的代謝過程，導(dǎo)致Aβ的生成增多。劉慧莉等人[6]通過TUNEL和NISSL染色方法證實APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬出現(xiàn)大量的神經(jīng)細胞凋亡和齒狀回神經(jīng)元丟失現(xiàn)象。Aβ導(dǎo)致的細胞凋亡是通過Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族基因調(diào)控的。Aβ可能通過改變Bcl-2/Bax比值，同時激活Caspase并引發(fā)Caspase酶鏈鎖反應(yīng)，促進神經(jīng)細胞過度凋亡。Aβ可以降低Bcl-2的表達水平，誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡，而過度表達Bcl-2可降低Aβ的神經(jīng)毒性，提高神經(jīng)元的存活率。

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究較多轉(zhuǎn)基因AD小鼠，7月齡時腦內(nèi)可見明顯的Aβ沉積，海馬神經(jīng)元丟失增多。本研究結(jié)果證實，7月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠抑制海馬神經(jīng)細胞凋亡的能力低于野生對照組，而10周的跑臺運動顯著降低APP/PS1小鼠海馬Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8和cyt-c mRNA的表達水平，提示跑臺運動通過減少促凋亡因子的表達抑制AD小鼠海馬細胞凋亡。研究[7]證實，16周的跑臺運動降低NSE/APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬cyt-c、Caspase-3、Caspase-9和Bax的表達水平，增加了NSE/APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Bcl-2mRNA的表達水平。研究[8]發(fā)現(xiàn)，3個月的跑臺運動降低NSE/hPS2m轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層Caspase-3mRNA的表達水平，提高大腦皮層Bcl-2/Bax比值。上述研究結(jié)果提示，運動通過提高海馬神經(jīng)細胞抗凋亡能力，達到預(yù)防和緩解AD的目的。

海馬神經(jīng)細胞異常凋亡將導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙疾病的發(fā)生，AD患者腦內(nèi)神經(jīng)細胞凋亡增多。運動可以增強突觸可塑性，抑制神經(jīng)細胞凋亡，但運動調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)細胞凋亡的確切機制尚不明確。目前就運動影響APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠神經(jīng)細胞凋亡的研究成果相對較少，研究[8]證實，小強度的跑臺運動通過抑制海馬神經(jīng)細胞凋亡，減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬齒狀回神經(jīng)元的丟失。但該研究僅通過TUNEL和NISSL染色方法觀察了跑臺運動對AD小鼠海馬齒狀回細胞凋亡的影響情況，沒有對細胞凋亡相關(guān)基因表達情況進行檢測。本研究對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠進行10周的跑臺運動干預(yù)，結(jié)果證實，跑臺運動通過下調(diào)促神經(jīng)細胞凋亡基因Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8和cyt-c mRNA的表達水平，提高了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬細胞抗凋亡能力，降低了海馬神經(jīng)元細胞凋亡。

Parkin是位于6q25-27與家族性帕金森綜合征密切相關(guān)的基因，是最早發(fā)現(xiàn)的家族性帕金森綜合征致病基因并命名為Parkin[9]。Parkin表達于人體所有組織，Parkin可以通過底物蛋白的泛素化調(diào)節(jié)線粒體自噬、蛋白降解，參與帕金森綜合征的發(fā)病過程等。Parkin能夠抑制由線粒體應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護功能。Parkin參與線粒體通路介導(dǎo)的細胞凋亡過程，在細胞受到外界刺激情況下，Parkin通過募集線性泛素分子組合成復(fù)合體，通過提高NF-κB關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子(NF-κB essential modulator，NEMO)線性泛素化水平，然后進一步激活線粒體視神經(jīng)萎縮相關(guān)蛋白1(optic atrophy type1，OPA1)，提高OPA1的轉(zhuǎn)錄水平，OPA1上調(diào)能夠維持線粒體完整性和阻止細胞凋亡，形成Parkin-NEMO-OPA1信號通路。cyt-c是位于線粒體內(nèi)膜的水溶性蛋白，是最早發(fā)現(xiàn)的由線粒體釋放的促細胞凋亡蛋白，正常情況下cyt-c不能透過線粒體外膜，而當(dāng)線粒體外膜蛋白聚合成膜通透轉(zhuǎn)運孔(permeability transition pore，PTP)復(fù)合體，外界刺激使PTP通透性增加導(dǎo)致水分進入線粒體，并最終引起cyt-c釋放，而胞質(zhì)內(nèi)以單體存在的Bax在受到外界刺激時形成聚合物整合到線粒體上，使線粒體外膜通透性增加，導(dǎo)致cyt-c釋放增多，從而誘導(dǎo)了細胞凋亡的發(fā)生。Parkin能夠抑制因凋亡刺激誘導(dǎo)的線粒體cyt-c的釋放，證實了Parkin抗細胞凋亡作用與線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡相關(guān)。而線粒體cyt-c的釋放同樣受OPA1活性的影響，提示Parkin-NEMO-OPA1抗凋亡通路通過抑制線粒體cyt-c的釋放抑制細胞凋亡的發(fā)生。本實驗結(jié)果顯示，7月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Parkin-NEMO-OPA1信號通路關(guān)鍵分子Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達水平顯著低于正常對照組，差異具有顯著性，而cyt-c、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA的表達水平均顯著高于正常對照組，提示APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Parkin-NEMO-OPA1抗細胞凋亡能力下降，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠海馬線粒體cyt-c釋放增多，上調(diào)Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8等基因的表達水平，引起海馬細胞凋亡增多。

耐力訓(xùn)練增加了2型糖尿病小鼠海馬Parkin和OPA1的表達水平[10]。近期的研究也證實，2周的跑臺訓(xùn)練顯著增加腦缺血大鼠皮層OPA1的表達水平[11]，提示跑臺運動可能通過提高OPA1mRNA的表達水平，發(fā)揮神經(jīng)保護功能。目前還沒有就Parkin-NEMO-OPA1抗凋亡通路對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡方面的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，10周的跑臺運動上調(diào)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達水平，抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬cyt-c、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA的表達，提示跑臺運動通過提高Parkin抗凋亡通路關(guān)鍵分子Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達水平，降低線粒體cyt-c的釋放和Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA表達水平，抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬細胞凋亡。

4 結(jié) 論

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Parkin-NEMO-OPA1抗凋亡通路mRNA的表達水平下降導(dǎo)致海馬線粒體cyt-c和Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8等促凋亡基因的表達水平提高，導(dǎo)致APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬細胞凋亡增加。而10周的跑臺運動通過提高Parkin-NEMO-OPA1抗凋亡通路Parkin、NEMO和OPA1mRNA的表達水平，降低線粒體cyt-c的釋放和Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8mRNA的表達水平，抑制AD小鼠海馬細胞凋亡。