PASM-Masson和IV型膠原染色在內(nèi)翻性與浸潤性膀胱癌鑒別診斷中的應(yīng)用

向榮 曲利娟 徐寶卿

【摘要】目的：探討PASM-Masson和IV型膠原染色在內(nèi)翻性與浸潤性膀胱尿路上皮癌鑒別診斷中的意義。方法：收集診斷為內(nèi)翻性生長和浸潤性生長的膀胱尿路上皮癌HE切片病例共100例，分別對(duì)其進(jìn)行PASM-Masson染色和IV型膠原染色。結(jié)果：PASM-Masson染色和IV型膠原染色均能清晰地顯示出尿路上皮基底膜完整或者缺損情況。PASM-Masson染色：浸潤性生長尿路上皮癌中基底膜染色完整4例，缺損46例;內(nèi)翻性生長尿路上皮癌中基底膜染色完整42例，缺損8例，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。IV型膠原染色：浸潤性生長尿路上皮癌中基底膜染色完整3例，缺損47例;內(nèi)翻性生長尿路上皮癌中基底膜染色完整40例，缺損10例，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。結(jié)論：PASM-Masson和IV型膠原染色可用來鑒別診斷膀胱尿路上皮癌內(nèi)翻性生長和浸潤性生長，對(duì)膀胱尿路上皮癌有無浸潤的診斷具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】 膀胱尿路上皮癌;PASM-Masson;IV型膠原;內(nèi)翻;浸潤

【中圖分類號(hào)】R181.3+【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】2095-6851（2019）02-034-01

膀胱癌是發(fā)生在膀胱黏膜上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)腫瘤排第一位[1]。膀胱癌中最常見的是尿路上皮癌，非浸潤性膀胱尿路上皮癌和浸潤性膀胱尿路上皮癌的侵襲性和惡性程度不一樣，區(qū)分兩者對(duì)于患者的治療和預(yù)后具有重要意義。內(nèi)翻性尿路上皮癌具有內(nèi)生的生長方式[2]，但腫瘤組織未突破基底膜生長。在無法明確診斷的情況下，單純依靠普通HE切片，會(huì)出現(xiàn)誤診。尤其是內(nèi)翻性生長的癌有時(shí)候細(xì)胞形態(tài)紊亂，炎癥反應(yīng)較重，結(jié)構(gòu)異型，很難判斷是否發(fā)生浸潤。由于內(nèi)翻性生長的非浸潤性尿路上皮癌常具有完整的基底膜，通過判斷基底膜的完整性可鑒別有無發(fā)生浸潤。常規(guī)HE切片基底膜著色較差，有時(shí)難以明確診斷。因此本研究采用特殊染色和免疫組化染色來顯示膀胱癌基底膜的表達(dá)情況，進(jìn)而判斷膀胱尿路上皮癌內(nèi)翻性生長和浸潤性生長。選取南京軍區(qū)福州總醫(yī)院2012年1月-2018年8月膀胱尿路上皮癌100例，分別對(duì)其進(jìn)行PASM-Masson染色和IV型膠原染色，探討其病理學(xué)特征。

1資料和方法

1.1材料

1.1.1收集2012年1月至2018年8月在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理切片及蠟塊100例，其中病理診斷為內(nèi)翻性生長尿路上皮癌50例，浸潤性生長尿路上皮癌50例，年齡為22-70歲，中位年齡46歲。

1.1.2主要試劑與儀器 10%福爾馬林;IV型膠原鼠抗人單克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）;六氨銀水溶液（實(shí)驗(yàn)室自配）;組織包埋機(jī)（LEICA公司）;輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（LEICA 公司）;電熱恒溫干燥箱（上海一恒科技有限公司）;顯微鏡（OLYMPUS 公司）;顯微鏡數(shù)碼照相系統(tǒng)（OLYMPUS 公司）

1.2染色方法

1.2.1制片 取膀胱尿路上皮標(biāo)本組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，3μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟脫水。

1.2.2免疫組化染色法 按照石蠟切片免疫組化EnVision二步法染色主要步驟：組織切片二甲苯脫蠟5分鐘X 3次，100%、95%和75%乙醇脫水各5分鐘，自來水流洗5分鐘;高溫高壓抗原修復(fù);蛋白酶消化液當(dāng)日配置并37℃預(yù)熱，切片消化后用PBS洗3次，每次2min;切片浸入3%過氧化氫水溶液10分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;PBS洗3次，每次2分鐘;加第一抗體，室溫下孵育20min，PBS洗3次，每次2min;滴加酶標(biāo)抗鼠聚合物，室溫孵育30分鐘，PBS洗3次，每次2min;滴加新鮮配置的AEC顯色液;鏡下控制顯色1-3分鐘，水洗2分鐘，改良Carazzi蘇木素液復(fù)染，流水洗5分鐘;濕片組織上滴加水性封片劑，烤干后再用中性樹膠加蓋玻片二次封片。

1.2.3PASM-Masson染色法 切片浸入新鮮配置的3%過碘酸水溶液20分鐘，水洗3分鐘，蒸餾水洗3次;浸入六胺銀工作液，水浴58℃-60℃中染色50-60分鐘，每0.5小時(shí)換液一次，顯微鏡下控制，直到基底膜呈黑色為止，蒸餾水洗3次;用0.2%氯化金水溶液調(diào)色約2分鐘，蒸餾水洗2次;浸入0.25%硫代硫酸鈉水溶液中2-3分鐘，水洗3分鐘;改良Carazzis蘇木素液染色20-30分鐘，水洗;1%鹽酸水溶液中過一下，Masson液中染色5-7分鐘，水洗;在0.1%固綠水溶液中染色2-3秒，急入水洗;梯度乙醇脫水，吹干，中性樹膠封片。

1.2.4結(jié)果判讀 IV型膠原表現(xiàn)為連續(xù)完整的棕黃色線性結(jié)構(gòu)標(biāo)為（+），表現(xiàn)為連續(xù)性中斷、染色淺淡或缺失標(biāo)為（-）。PASM-Masson染色細(xì)胞核呈紅色，免疫復(fù)合物呈紅色，基底膜呈黑色、膠原纖維呈黃綠色;基底膜染色連續(xù)完整標(biāo)為（+），基底膜染色連續(xù)性中斷標(biāo)為（-）。

1.3統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用Fish確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

一? IV型膠原在膀胱尿路上皮癌組織的表達(dá) 免疫組化顯示，內(nèi)翻性生長尿路上皮癌基底膜IV型膠原染色連續(xù)完整，浸潤性生長尿路上皮癌基底膜IV型膠原染色中斷、不連續(xù)（見圖1、2）。內(nèi)翻性生長尿路上皮癌基底膜IV型膠原染色陽性40例，浸潤性生長尿路上皮癌基底膜IV型膠原染色陽性4例，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示內(nèi)翻性和浸潤性尿路上皮癌基底膜IV型膠原表達(dá)差異明顯（P<0.01），見表一。

二? PASM-Masson染色在膀胱尿路上皮癌組織的表達(dá)? 特殊染色顯示，內(nèi)翻性生長尿路上皮癌基底膜染色連續(xù)完整，浸潤性生長尿路上皮癌基底膜染色中斷（見圖3、4）。內(nèi)翻性生長尿路上皮癌基底膜PASM-Masson染色陽性42例，浸潤性生長尿路上皮癌基底膜PASM-Masson染色陽性4例，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示內(nèi)翻性和浸潤性尿路上皮癌基底膜PASM-Masson染色表達(dá)差異明顯（P<0.01），見表二。

3討論

膀胱尿路上皮癌病理學(xué)分型較多，內(nèi)翻生長型尿路上皮癌是其特殊亞型，是一種少見的臨床類型。國內(nèi)外對(duì)其報(bào)道較少，由國外學(xué)者Amin[3]首次提出的一種名稱。其病理生長方式常表現(xiàn)為內(nèi)生性、膨脹性生長，伴或不伴周圍基底樣細(xì)胞的柵欄狀排列。內(nèi)翻生長性尿路上皮癌一般具有外生性生長成分，少見的病例不伴外生性生長成分表。它常見于中老年男性患者，通常表現(xiàn)為無痛性、間歇性、肉眼全程血尿，膀胱鏡檢查是診斷膀胱癌的最主要方法。膀胱癌的預(yù)后與腫瘤分級(jí)、分期、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目等因素密切相關(guān)，其中腫瘤的病理分級(jí)和分期是最重要因素之一[4]。膀胱癌的病理分期受腫瘤浸潤程度的影響，進(jìn)一步影響到患者預(yù)后評(píng)估。

日常病理中，內(nèi)翻生長性尿路上皮癌與內(nèi)翻性尿路上皮乳頭狀瘤在診斷中較好區(qū)分，內(nèi)翻性尿路上皮乳頭狀瘤外觀是外生性，無炎癥，外覆蓋正常上皮;上皮厚度、層次及形狀與正常上皮相似（或局灶輕度異型）;少量非游離性乳頭為特征。通過普通HE切片及免疫組化標(biāo)記Ki-67、CK20等比較好鑒別。尤其是Ki-67特異性明顯，相關(guān)文獻(xiàn)顯示，Ki-67在膀胱內(nèi)翻性尿路上皮癌的表達(dá)有5%-8%，而Ki-67在內(nèi)翻性生長的尿路上皮乳頭狀瘤的表達(dá)只有不到1%[5-6]。因此區(qū)分二者比較容易。內(nèi)翻生長性尿路上皮癌表面常呈粗菜花狀，上皮條索較寬，粗細(xì)不一，實(shí)性細(xì)胞巢不規(guī)則，細(xì)胞異型性明顯。浸潤性尿路上皮癌，常常呈浸潤性生長，往肌層滲透，破壞組織結(jié)構(gòu)，基底膜常不規(guī)則、斷裂或者缺失。而內(nèi)翻性尿路上皮癌和浸潤性尿路上皮癌有時(shí)難區(qū)分，在診斷內(nèi)翻性尿路上皮癌時(shí)，常通過HE切片觀察細(xì)胞形態(tài)，腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊跟組織間隙的關(guān)系，看腫瘤細(xì)胞是圓潤的生長還是浸潤破壞的生長，但此種方式不一定能夠完全區(qū)分是否存在浸潤。由于其生長方式跟浸潤性癌一樣，并且HE切片會(huì)產(chǎn)生誤差，容易誤診為浸潤癌。浸潤性膀胱癌在發(fā)生微浸潤或結(jié)構(gòu)紊亂的癌組織，浸潤癌的間質(zhì)反應(yīng)可缺如，炎癥反應(yīng)也可覆蓋浸潤區(qū)域，此時(shí)很難區(qū)分有無浸潤。這些給臨床病理診斷帶來了一定的困難。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤侵襲破壞正常組織是一個(gè)復(fù)雜多步驟過程?；啄ぴ谶@里扮演了重要角色，基底膜作為正常組織和腫瘤組織之間的一層屏障，能夠顯示腫瘤細(xì)胞有沒有發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。文獻(xiàn)顯示，正常膀胱粘膜上皮基底膜常常是完整的，而在浸潤性膀胱癌組織中基底膜常見缺損、斷裂，甚至基底膜輪廓消失[7]。內(nèi)翻性生長的膀胱尿路上皮癌，常未發(fā)生浸潤，基底膜完整連續(xù)。由于其HE切片形態(tài)有時(shí)模棱兩可，如果將其誤診為浸潤性尿路上皮癌，會(huì)影響臨床評(píng)估。內(nèi)翻性尿路上皮癌的預(yù)后一般比浸潤性尿路上皮癌好[8]。目前尚未見學(xué)者將IV型膠原和PASM-Masson染色用于內(nèi)翻性膀胱尿路上皮癌的診斷應(yīng)用，內(nèi)翻性尿路上皮癌由于未發(fā)生浸潤，其基底膜完整，我們創(chuàng)新首次將PASM-Masson和免疫組化（IV型膠原）雙重標(biāo)記內(nèi)翻生長腫瘤外層基底膜，以此判斷腫瘤有無突破基底膜發(fā)生浸潤。

本研究結(jié)果顯示，PASM-Masson和 IV型膠原標(biāo)記基底膜效果明顯。在內(nèi)翻性生長尿路上皮癌組IV型膠原和PASM-Masson染色顯示基底膜光滑而完整，著色清晰，呈連續(xù)性;而在浸潤性生長尿路上皮癌組IV型膠原和PASM-Masson染色顯示基底膜物質(zhì)消失且出現(xiàn)缺口，甚至基底膜連續(xù)性斷裂。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，IV型膠原和PASM-Masson染色在內(nèi)翻性生長尿路上皮癌基底膜陽性（共80例）表達(dá)率明顯高于浸潤生長組（共7例），IV型膠原和PASM-Masson染色在比較內(nèi)翻性和浸潤性生長尿路上皮癌表達(dá)差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表明IV型膠原和PASM-Masson染色有助于鑒別診斷浸潤性和內(nèi)翻性生長尿路上皮癌。

綜上，在臨床工作中，對(duì)于很難通過HE切片區(qū)分的膀胱尿路上皮癌內(nèi)翻性生長和浸潤性生長病例。運(yùn)用IV型膠原和PASM-Masson染色輔助診斷這類型病例，極大提高了診斷的正確率，有助于臨床評(píng)估。

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