微流控芯片中亞硝酸鹽的圖像分析方法研究

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(1.安徽理工大學(xué),安徽淮南 232000; 2.浙江清華長(zhǎng)三角研究院分析測(cè)試中心,浙江嘉興 314006; 3.國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心應(yīng)用技術(shù)合作中心,浙江嘉興 314006)

亞硝酸鹽不僅能抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖,并且能對(duì)食品進(jìn)行保鮮。然而,有研究發(fā)現(xiàn),亞硝酸鹽不僅具有致癌性,而且與人類先天畸變有關(guān)系[1-2];人體血液中亞硝酸鹽濃度為0.4～200 mg/kg時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性,1 g亞硝酸鹽即可致人死亡[3]。因此,針對(duì)食品中亞硝酸鹽的含量,我國(guó)制定了許多嚴(yán)格的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。

目前用于亞硝酸鹽的檢測(cè)方法主要分為兩大類,一類是傳統(tǒng)的精密儀器檢測(cè)分析方法,主要包括色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、離子色譜法、電化學(xué)方法等[6-8];另一類是現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法,主要為比色法、分光光度法等[9-10]。精密儀器分析方法雖然精度高、靈敏度高,但操作繁瑣,設(shè)備昂貴,需要專業(yè)人員操作,無法滿足對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、快速、微量化、便攜化的檢測(cè)需要[11]?，F(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法中的比色法主要采用試劑盒顯色反應(yīng)后,檢測(cè)者將反應(yīng)后的溶液顏色與標(biāo)準(zhǔn)比色卡進(jìn)行人眼判讀,從而快速獲得定性分析結(jié)果,這種方法雖然成本低、操作方便、檢測(cè)時(shí)間短,但準(zhǔn)確度低、誤差大[12-13];分光光度法主要使用分光光度計(jì)對(duì)顯色反應(yīng)后的溶液直接進(jìn)行定量分析,但操作步驟繁瑣,需要現(xiàn)場(chǎng)配制及多次移取溶液,而且需要專業(yè)人員進(jìn)行操作[13-14]。因此,研究更加簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的亞硝酸鹽測(cè)定方法具有一定的實(shí)際需求。

近年來,基于紙基微流控芯片和圖像分析技術(shù)的快速檢測(cè)方法[15-17],已被用于生化顯色反應(yīng)結(jié)果的快速定量檢測(cè)。例如,趙聯(lián)朝[15]等開發(fā)了一種用于亞硝酸根離子檢測(cè)的過氯乙烯樹脂紙基微流控芯片,采用Photoshop軟件計(jì)算紙基微流控芯片上的顯色強(qiáng)度,實(shí)現(xiàn)了水樣和食品中亞硝酸根離子測(cè)定;肖良品[16]等提出使用中性濾紙為基材的三維紙芯片,結(jié)合自制的比色檢測(cè)裝置,采用Photoshop軟件檢測(cè)自來水中的亞硝酸鹽。上述方法不僅試劑用量少,而且分析速度快、成本低、操作簡(jiǎn)單,可實(shí)現(xiàn)一定濃度范圍內(nèi)亞硝酸鹽的快速定量分析。然而在圖像分析過程中,紙基微流控芯片中容易受濾紙或高分子膜的形貌及材料本體顏色的干擾[11,18]導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果誤差較大。

本文提出一種基于微流控芯片液相反應(yīng)[19-20]結(jié)合圖像分析技術(shù)的亞硝酸鹽檢測(cè)方法。通過微泵驅(qū)動(dòng)待測(cè)溶液在具有二級(jí)串聯(lián)式通道的微流控芯片中,依次與預(yù)先固定于芯片內(nèi)部的兩種試劑發(fā)生化學(xué)顯色反應(yīng);使用自行搭建的圖像采集平臺(tái)對(duì)微量反應(yīng)池的封閉溶液進(jìn)行圖像采集,基于OpenCV(計(jì)算機(jī)視覺庫)圖像庫中的處理方法,建立圖像處理的方法和步驟,計(jì)算獲得亞硝酸鹽顯色溶液的相對(duì)灰度值[21],從而定量分析亞硝酸鹽濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽酸萘乙二胺、對(duì)氨基苯磺酸 上海士峰生物科技有限公司;36%鹽酸 國(guó)藥集團(tuán);亞硝酸鈉 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;杭州當(dāng)?shù)厥惺叟D肉;光學(xué)級(jí)聚甲基丙烯酸甲酯板材(PMMA) 蘇州揚(yáng)清芯片科技有限公司。

U-2900型紫外可見分光光度計(jì) 日立公司;JA1203B型電子天平 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;KFSHAA2B03G型蠕動(dòng)泵 卡川爾流體科技有限公司;RER-USB8MP02G型攝像頭 深圳市銳爾威視科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取0.01 g亞硝酸鈉,溶解定容至10 mL,配制成1 g/L的亞硝酸鹽溶液作為母液。實(shí)驗(yàn)中待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液依此母液稀釋而成。20%鹽酸溶液:量取36%的鹽酸10 mL,稀釋定容至18 mL。亞硝酸鹽檢測(cè)試劑Ⅰ:稱取0.1 g對(duì)氨基苯磺酸,溶于20%鹽酸中,并用此鹽酸定容至10 mL;亞硝酸鹽檢測(cè)試劑Ⅱ:稱取0.08 g鹽酸萘乙二胺,加入蒸餾水,溶解定容至10 mL。實(shí)驗(yàn)中所用水均為蒸餾水。

1.2.2 檢測(cè)原理 待測(cè)溶液中的亞硝酸鹽依次與試劑Ⅰ、試劑Ⅱ充分反應(yīng)后,生成玫瑰紅溶液,可以通過溶液的顏色深淺來表征亞硝酸鹽濃度[22-23]。實(shí)驗(yàn)過程為:首先在芯片上進(jìn)行亞硝酸鹽的顯色反應(yīng);將充分反應(yīng)后的芯片放入檢測(cè)裝置中,啟動(dòng)圖像采集系統(tǒng);對(duì)采集到的圖像進(jìn)行處理,計(jì)算顯色反應(yīng)池內(nèi)的平均灰度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽顯色溶液的平均灰度值與亞硝酸鹽濃度,獲得濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,為定量檢測(cè)食品中亞硝酸鹽的含量提供技術(shù)保證和理論依據(jù)。

1.2.3 微流控芯片結(jié)構(gòu)與反應(yīng)流程 本文所采用的PMMA微流控芯片厚度為3 mm,其中顯色反應(yīng)池的深度為2 mm。芯片結(jié)構(gòu)如圖1a所示,包括進(jìn)樣口、初級(jí)反應(yīng)池、顯色反應(yīng)池和微泵接口。

芯片封裝前,采用凍干工藝[24]預(yù)先將10 μL的試劑Ⅰ和10 μL試劑Ⅱ分別存儲(chǔ)到微流控芯片的初級(jí)反應(yīng)池和顯色反應(yīng)池內(nèi)。檢測(cè)時(shí),首先通過微泵定量吸取150 μL待測(cè)樣品溶液于初級(jí)反應(yīng)池內(nèi);充分反應(yīng)后,再通過微泵將初級(jí)反應(yīng)池內(nèi)的溶液吸入到顯色反應(yīng)池,自動(dòng)進(jìn)行化學(xué)顯色反應(yīng),如圖1b所示。

圖1 微流控芯片結(jié)構(gòu)及進(jìn)樣反應(yīng)流程Fig.1 Structure of microfluidic chip and injection reaction flow

1.2.4 圖像采集平臺(tái) 光源及拍照環(huán)境對(duì)圖像質(zhì)量以及后續(xù)圖像處理、分析影響較大,本文設(shè)計(jì)并搭建了用于提供光源的暗箱圖像采集裝置,如圖2所示,暗箱圖像采集裝置包括微流控芯片固定平臺(tái)、攝像頭及LED環(huán)形燈組。攝像頭安裝在芯片正上方,LED燈組安裝在攝像頭周圍環(huán)形均勻分布保證拍照光源的均一性。

圖2 圖像采集裝置結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of image acquisition device

1.2.5 反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 配制10 mg/L的亞硝酸鈉溶液作為待測(cè)液,使用微泵定量吸取150 μL待測(cè)液于初級(jí)反應(yīng)池內(nèi),靜置反應(yīng)一段時(shí)間,確保亞硝酸鹽與試劑I反應(yīng)完全;再通過微泵將初級(jí)反應(yīng)池內(nèi)的溶液吸入到顯色反應(yīng)池,調(diào)節(jié)分光光度計(jì)的檢測(cè)波長(zhǎng)為540 nm[25],監(jiān)測(cè)顯色反應(yīng)池中吸光度隨時(shí)間的變化情況。

1.2.6 圖像分析方法 為了計(jì)算顯色反應(yīng)池區(qū)域的相對(duì)灰度值,需要分割出背景區(qū)域與顯色反應(yīng)池區(qū)域,本文基于Visual Studio 2012平臺(tái)和OpenCV圖像庫進(jìn)行處理操作,運(yùn)用灰度二值化處理、圖像形態(tài)學(xué)運(yùn)算及圖像濾波等圖像處理方法,對(duì)背景區(qū)域與顯色反應(yīng)池進(jìn)行分割,分別計(jì)算背景圖像灰度值與顯色反應(yīng)池區(qū)域灰度值,根據(jù)公式Gr=Gb-Gf計(jì)算相對(duì)灰度值,其中,Gr為相對(duì)灰度值,Gb為背景灰度值,Gf為前景灰度值。

1.2.7 系統(tǒng)考察

1.2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 配制濃度分別為0.5、2、4、6、8、10 mg/L的亞硝酸鈉溶液進(jìn)行系統(tǒng)考察,按照?qǐng)D像處理流程對(duì)顯色反應(yīng)后的微流控芯片進(jìn)行圖像采集及分析,以亞硝酸鈉溶液濃度為橫坐標(biāo),分析獲得的相對(duì)灰度值為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性擬合分析,繪制亞硝酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)檢出限公式MDL=St(n-1,0.99)計(jì)算檢出限。

1.2.7.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 將市售臘肉切成約1 mm×1 mm的小碎片,用天平稱取2.0 g置于燒杯中,加入蒸餾水20 mL,浸泡10～15 min,取樣品上清液10 mL于離心管中,備用。

用本文方法對(duì)臘肉提取液做樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),對(duì)空白自來水溶液做空白加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),臘肉提取液和自來水溶液分別測(cè)定3組樣品,每組測(cè)定6次,計(jì)算6次測(cè)量濃度結(jié)果的均值、回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。

1.2.8 方法對(duì)比 分別考察文中方法、試劑盒結(jié)合分光光度計(jì)法[9]和試劑盒結(jié)合比色卡法[10]在試劑、檢測(cè)時(shí)間、樣品用量、試劑消耗量、準(zhǔn)確性以及操作步驟六個(gè)指標(biāo),并將文中方法分別與試劑盒結(jié)合分光光度法、試劑盒結(jié)合比色卡法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)考察

圖3a顯示了微流控芯片顯色反應(yīng)池中亞硝酸鹽與試劑Ⅱ的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過程曲線,當(dāng)待測(cè)液進(jìn)入顯色反應(yīng)池后,0～90 s時(shí)間內(nèi)溶液吸光度不斷增大,表明顯色反應(yīng)的快速進(jìn)行;90～150 s時(shí)間內(nèi),溶液吸光度繼續(xù)增大,但增速緩慢,表明顯色反應(yīng)接近終點(diǎn);當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于150 s時(shí),溶液的吸光度基本保持不變,表明顯色反應(yīng)結(jié)束,因此本文選擇150 s作為檢測(cè)時(shí)間。

同時(shí)還發(fā)現(xiàn),初級(jí)反應(yīng)池內(nèi)的反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)穩(wěn)定后的吸光度也有一定的影響,隨著初級(jí)反應(yīng)池反應(yīng)時(shí)間的增加,顯色反應(yīng)池中的溶液吸光度逐漸增大,如圖3b所示,初級(jí)反應(yīng)池內(nèi)反應(yīng)時(shí)間在30～210 s內(nèi)時(shí),溶液吸光度緩慢增大,在210 s后基本保持不變,為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,本文選擇初級(jí)反應(yīng)池反應(yīng)時(shí)間為210 s。

圖3 亞硝酸鈉反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Reaction kinetics curves of sodium nitrite

2.2 圖像處理分析

圖4a為微流控芯片的原始灰度圖片,可以看出芯片邊緣部分有背景光干擾,對(duì)顯色反應(yīng)池的圖像分析將會(huì)產(chǎn)生較大影響。同時(shí),考慮到芯片壁、非擴(kuò)散區(qū)域的影響,需要對(duì)圖像進(jìn)行分割。

首先通過OpenCV對(duì)圖像進(jìn)行二值化處理。如圖4b所示,對(duì)原始灰度圖像進(jìn)行提取,可以得到如圖4c所示的背景灰度圖像,背景灰度圖像并不包含微流控芯片和顯色反應(yīng)池區(qū)域,可用于計(jì)算背景灰度值。經(jīng)二值化處理后的圖像存在明顯的孤立點(diǎn)和細(xì)小線條,這些點(diǎn)和線條并不屬于顯色區(qū)域;圖像形態(tài)學(xué)的開運(yùn)算可以消除孤立點(diǎn)與細(xì)小線條,并且在平滑較大的邊界并不明顯改變其面積,通過調(diào)用OpenCV中的圖像形態(tài)學(xué)運(yùn)算函數(shù)對(duì)圖像進(jìn)行開運(yùn)算處理,處理后的二值圖像明顯去除了目標(biāo)區(qū)域的孤立點(diǎn)和部分細(xì)小線條(圖4d)。

以二值圖像為掩膜,對(duì)原始灰度圖像進(jìn)行提取,可以得到如圖4e所示的灰度圖像,由于圖像中明顯存在噪聲,需要進(jìn)一步對(duì)圖像進(jìn)行濾波處理。由于溶液顏色具有單一性,理論上溶液各處顏色相同,即灰度值相同,需要對(duì)該灰度值兩側(cè)的噪音進(jìn)行濾波,本文選擇帶通濾波。

遍歷圖4e各像素點(diǎn)的灰度值,統(tǒng)計(jì)各灰度值(零灰度值除外)的像素點(diǎn)數(shù)量,選擇像素點(diǎn)數(shù)量處于峰值狀態(tài)時(shí)的灰度值,以此灰度值為中心,進(jìn)行帶通濾波。多次實(shí)驗(yàn)表明,濾波帶寬為5～9個(gè)灰度值時(shí),計(jì)算結(jié)果相差不到0.3個(gè)灰度值,隨著濾波帶寬的增加,所提取到的顯色區(qū)域比較完整。本文所取濾波帶寬為9個(gè)灰度值,如圖4f所示,明顯去除了顯色區(qū)域的噪聲,可以用于計(jì)算顯色反應(yīng)池的灰度值,根據(jù)背景灰度值和顯色反應(yīng)池的灰度值計(jì)算相對(duì)灰度值。

圖4 圖像處理分析Fig.4 Image analysis with different treatments

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5為亞硝酸鈉溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明,擬合方程為y=8.2219x+4.6389,決定系數(shù)R2=0.9927,線形范圍在0.5～10 mg/L之間,檢出限為0.8 mg/L。

圖5 亞硝酸鈉溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of sodium nitrite solution

2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

表1列出了不同樣品基質(zhì)下的加標(biāo)回收結(jié)果。未加標(biāo)時(shí),測(cè)得臘肉提取液的亞硝酸鹽濃度是1.89 mg/L。在不同的基質(zhì)中,所測(cè)得的回收率在94.1%～108.0%之間,表明微流控芯片系統(tǒng)的準(zhǔn)確度較好,因此,文中方法可以用來進(jìn)行亞硝酸鹽的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。

表1 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 1 The results of recovery(n=6)

2.5 方法對(duì)比

表2為本文方法和傳統(tǒng)亞硝酸鹽快速檢測(cè)方法對(duì)比的結(jié)果。本文方法可直接將亞硝酸鹽檢測(cè)試劑預(yù)存儲(chǔ)于微流控芯片內(nèi)部,無需現(xiàn)場(chǎng)配制溶液,只需簡(jiǎn)單的人工操作即可實(shí)現(xiàn)。樣品消耗量約為分光光度法的1/4,試劑消耗量約為分光光度法的1/3;試劑消耗約為比色法的1/30,樣品用量約為比色法的1/24,可以滿足定量檢測(cè)亞硝酸鹽濃度的要求。相對(duì)于傳統(tǒng)的快速檢測(cè)方法,本文方法具有以下優(yōu)點(diǎn):基于微流控芯片的液相反應(yīng),保證化學(xué)顯色反應(yīng)更為均一、穩(wěn)定可控;樣品試劑消耗量少,檢測(cè)時(shí)間短;液相使用PMMA為芯片材料,芯片成本低、易于批量化生產(chǎn)。

表2 微流控技術(shù)和傳統(tǒng)亞硝酸鹽快速檢測(cè)方法對(duì)比Table 2 Comparison of microfluidic technology and traditional nitrite rapid detection method

3 結(jié)論

本文提出了一種基于圖像分析技術(shù)的微流控芯片中亞硝酸鹽快速檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)了對(duì)亞硝酸鹽的低成本、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。采用自行搭建的拍照裝置結(jié)合圖像分析技術(shù),自動(dòng)截取并獲得微流控芯片中顯色區(qū)域的相對(duì)灰度值,實(shí)現(xiàn)了亞硝酸鹽的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,亞硝酸鹽溶液在0.5～10 mg/L濃度范圍區(qū)間,所測(cè)顯色溶液的相對(duì)灰度值與亞硝酸鹽濃度呈線性關(guān)系,決定系數(shù)是0.9927,檢測(cè)限可達(dá)到0.8 mg/L,加標(biāo)回收率在94.1%～108.0%之間,可用于食品中亞硝酸鹽的現(xiàn)場(chǎng)、低成本、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。綜上所述,本文提出的方法具有穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短,適合非專業(yè)人員的操作,有望滿足基于化學(xué)顯色反應(yīng)原理的檢測(cè)需求。