雞骨草多糖的酶法提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

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(1.玉林師范學院生物與制藥學院,廣西玉林 537000; 2.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學與生物技術重點實驗室,廣西玉林 537000)

雞骨草(AbruscantoniensisHance)是常見的藥食兩用植物,主要分布于我國廣西、廣東等地,為我國出口的創(chuàng)匯中草藥品種。雞骨草具有護肝利尿、清熱解毒之功效,是臨床治療肝炎、膽囊炎中成藥雞骨草膠囊的主藥材,也是兩廣地區(qū)夏季涼茶飲料、食湯等制備的主要成分之一[1-2],對雞骨草有效成分相關產(chǎn)品的研發(fā)將具有非常廣闊的應用前景。

研究表明，雞骨草多糖具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種功能[3-4]。近年來,對雞骨草化學成分研究主要集中于雞骨草三萜、黃酮及生物堿類[5-6],針對其多糖成分提取及相關生物功能的研究報道還很少。目前,雞骨草多糖提取主要采用傳統(tǒng)的水提醇沉、有機溶劑、超聲波輔助提取法,但獲得的雞骨草多糖得率普遍較低,且有機溶劑用量大[7]。酶解提取由于其操作簡單、條件較溫和、不需要大型設備,在成分結(jié)構與活性保持方面具有一定的優(yōu)勢[8],正逐漸被天然藥物工作者所采用。纖維素酶可通過破壞細胞壁的致密結(jié)構,加速藥用有效成分溶出,提高得率,被廣泛用于中草藥有效成分的提取。目前,尚未見酶法提取雞骨草多糖的相關報道。

因此,本文為進一步提高雞骨草多糖的得率,在單因素實驗的基礎上,結(jié)合響應面試驗,優(yōu)化了纖維素酶酶解提取雞骨草多糖的工藝條件,并探討其體外抗氧化活性,為雞骨草多糖進一步開發(fā)為藥品及食品抗氧化添加劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞骨草 廣西玉林中藥材市場,經(jīng)陳曉白教授鑒定為豆科植物廣州相思子的干燥全草;纖維素酶(50000 U/g)、維生素C、D-無水葡萄糖、·OH(羥自由基)清除能力檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 日本TCI公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

SHA-BA雙功能水浴恒溫振蕩器 常州華普達教學儀器;5810R型高速離心機 德國Eppendorf;PHS-25型pH計 上海雷磁;2L-ARE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、FD-A10N-50冷凍干燥機、SHB-III型循環(huán)水真空泵 上海皓莊儀器;Alpha-1506型紫外分光光度計 上海譜元儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞骨草多糖的提取 精確稱取5.0 g經(jīng)粉碎并過100目篩后的雞骨草干燥粉末,按設定酶解條件(pH、液料比、酶添加量、酶解時間、酶解溫度),在180 r/min搖床上用纖維素酶進行酶解提取實驗,得到多糖浸提液。多糖浸提液經(jīng)90 ℃高溫滅活、6000 r/min離心分離15 min、抽濾、濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀90 ℃濃縮至1/10、95%乙醇沉淀、Sevage法脫除蛋白、水層用95%乙醇二次沉淀、真空冷凍干燥(溫度-55 ℃,壓力0.05 MPa)等一系列步驟[9],最終得到雞骨草多糖。

1.2.2 多糖含量的測定 多糖測定采用苯酚-硫酸法[10],精確稱取經(jīng)干燥至恒重的標準無水葡萄糖20 mg,用50 mL蒸餾水定容,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL,以水補至2.0 mL,然后加入6%苯酚水溶液1.0 mL,再迅速加入濃硫酸5.0 mL,顯色后在冷水中冷卻,以蒸餾水代替糖溶液作空白對照,用紫外-可見分光光度計在490 nm的波長處測定吸光值,以吸光值為縱坐標,葡萄糖的濃度為橫坐標,繪制標準曲線。標準曲線方程為y=8.4986x-0.0185,R2=0.9903,式中y為490 nm條件下的吸光度值、x為葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)。準確稱取50 mg雞骨草多糖,定容至50 mL,測定樣品吸光值,根據(jù)標準曲線計算雞骨草多糖得率。

多糖得率Y(%)=cnV/m×100

其中,c為樣品稀釋液中多糖的濃度(mg/mL);n為稀釋倍數(shù);V為樣品稀釋液體積(mL);m為雞骨草粉末質(zhì)量(mg)。

隨著“數(shù)字化工廠”概念的提出和發(fā)展，數(shù)字化交付的方式逐漸得到認可，越來越多的石化項目開始應用三維模型技術。三維模型技術可以模擬生產(chǎn)裝置原貌，真實表現(xiàn)設備、管道的外形尺寸、空間位置，并且將相關數(shù)據(jù)信息集成融合，使實體裝置數(shù)字化，對裝置的建設和生產(chǎn)管理極為有利。

1.2.3 雞骨草多糖纖維素酶法提取的單因素實驗 酶解時搖床轉(zhuǎn)速固定為180 r/min,分別考察酶添加量3、6、9、12、15 mg/mL,pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,液料比6∶1、9∶1、12∶1、15∶1、18∶1、21∶1 mL/g,酶解溫度30、40、50、60 ℃和酶解時間30、60、90、120、150 min對雞骨草多糖得率的影響,其中各因素固定水平為pH5.0、液料比12∶1 mL/g、酶添加量12 mg/mL、酶解時間60 min、酶解溫度50 ℃。

1.2.4 雞骨草多糖纖維素酶法提取的響應面優(yōu)化試驗 響應面因素水平設計見表1,自變量包括液料比、酶解時間、酶添加量、酶解溫度四個因素,以多糖得率為響應值,對雞骨草多糖的提取工藝進行優(yōu)化。

表1 響應面試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 雞骨草多糖體外抗氧化活性的測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2 mL和2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)混勻,反應30 min后在517 nm處測定其吸光度A1,同法測定2.0 mL乙醇加樣液的吸光度A2,以及2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL蒸餾水的吸光度A0,以維生素C作為對照,樣品對DPPH自由基的清除率Y(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100[9]。

1.2.5.2 ·OH的清除能力測定 取不同質(zhì)量濃度的樣品提取液2 mL,依次加入濃度均為5 mmol/L的FeSO4溶液、H2O2溶液各2 mL,混勻,靜置10 min,再加入5 mmol/L的水楊酸溶液2 mL,混勻,37 ℃水浴30 min后,波長536 nm處測定吸光度B1,用蒸餾水代替水楊酸測定吸光度B2,以蒸餾水代替樣品溶液測定吸光度B0,以維生素C作為對照,樣品對·OH的清除率Y(%)=[1-(B1-B2)/B0]×100[9-10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所用數(shù)據(jù)是3次平行試驗結(jié)果的均值±標準差,采用 SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)間的顯著性分析,相同字母表示差異不顯著,不同字母表示0.05水平上差異顯著。利用GraphPad Prism 6.0軟件繪制折線圖。響應面試驗相關數(shù)據(jù)分析采用Design Expert 8.06軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量對多糖得率的影響 由圖1可知,當酶添加量為3.0～12.0 mg/mL時,多糖得率呈增加趨勢;酶添加量為12.0 mg/mL時,多糖得率可達7.94%;進一步加大酶用量至15.0 mg/mL,多糖得率沒有顯著變化(p>0.05),說明在該底物濃度下,酶濃度已經(jīng)趨于飽和,繼續(xù)增加纖維素酶用量,對多糖得率沒有顯著影響。因此選擇12.0 mg/mL作為酶的最佳添加量。

圖1 纖維素酶添加量對多糖得率的影響Fig.1 Influence of cellulase dosage on the polysaccharide extraction rate

2.1.2 酶解pH對多糖得率的影響 由圖2可知,當pH為3.0～5.0時,多糖得率呈增加趨勢;當pH增加到5.0時,多糖得率達到最大值7.81%;當pH為6.0時,多糖得率反而降低,但影響不顯著(p>0.05);進一步加大pH至7.0時,多糖得率顯著減小(p<0.05)。這是因為在最適pH時,酶分子上活性基團的解離狀態(tài)最適于與底物結(jié)合,故多糖得率最高,當pH高于或低于最適pH時,活性基團的解離狀態(tài)可能發(fā)生改變,酶和底物結(jié)合力減弱,酶反應速率降低，多糖得率降低。因此酶解最佳pH選定為5.0。

圖2 pH對多糖得率的影響Fig.2 Influence of pH on the polysaccharide extraction rate

圖3 液料比對多糖得率的影響Fig.3 Influence of the ratio of water to material on the polysaccharide extraction rate

2.1.4 酶解溫度對多糖得率的影響 由圖4可知,溫度為30～50 ℃時,多糖得率穩(wěn)步提升,主要因為隨著溫度升高酶活性增強,促進多糖溶出;溫度為50 ℃時,得率達到最大值7.89%;當溫度為60 ℃時,多糖得率顯著下降(p<0.05),這是由于溫度過高導致酶活力減弱所致。因此最佳酶解溫度定為50 ℃。

圖4 酶解溫度對多糖得率的影響Fig.4 Influence of hydrolysis temperature on the polysaccharide extraction rate

2.1.5 酶解時間對多糖得率的影響 由圖5可知,當酶解時間為30～60 min時,多糖得率呈增加趨勢;酶解60 min時,多糖得率為7.84%,接近90 min時的最大值7.97%,兩者比較差異不顯著(p>0.05);酶解時間120 min,多糖得率變化不顯著(p>0.05);此外,當酶解時間為150 min時,由于酶催化活性減弱，反而使多糖得率明顯降低?？紤]生產(chǎn)效率，選擇60 min為最佳酶解時間。

圖5 酶解時間對多糖得率的影響Fig.5 Influence of hydrolysis time on the polysaccharide extraction rate

2.2 雞骨草多糖纖維素酶提取的響應面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應面試驗結(jié)果與分析 試驗設計及結(jié)果見表2,回歸模型方差分析見表3。對表2中數(shù)據(jù)進行回歸擬合,獲得自變量(液料比、酶解時間、酶添加量、酶解溫度)與雞骨草多糖得率(Y)的二次多項回歸方程:

表2 雞骨草多糖提取的響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment for Abrus cantoniensis Hance polysaccharides extraction

表3 雞骨草多糖提取響應面試驗結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface design for Abrus cantoniensis Hance polysaccharides extraction

Y=8.16+0.45A+0.21B+0.47C+0.11D-0.24AB+0.23AC-0.14AD-0.18BC-0.17BD-0.013CD-0.71A2-0.61B2-0.68C2-0.27D2。

圖6 各因素交互作用對多糖得率影響的響應面圖Fig.6 Response surface graphs showing the interactions of various factors on polysaccharide yield

2.2.2 最佳提取條件預測及驗證 對回歸模型方程求解,獲得雞骨草多糖纖維素酶提取的最佳條件為液料比12.7∶1 mL/g,酶解時間60.3 min,酶添加量12.8 mg/mL,酶解溫度50.4 ℃,此條件下多糖得率預測值為8.34%?？紤]實際操作方便,將上述最佳提取參數(shù)修改為液料比13∶1 mL/g,酶解時間60 min,酶添加量12.8 mg/mL,酶解溫度50 ℃,根據(jù)工藝條件進行驗證實驗,所得多糖得率為8.15%±1.06%,與回歸方程理論多糖得率8.34%的相對誤差為2.28%,小于5.0%,提示本響應面法得到的回歸模型有效、可靠,得到的纖維素酶提取雞骨草多糖工藝條件具有實際應用價值。

2.3 雞骨草多糖的體外抗氧化活性

2.3.1 雞骨草多糖對DPPH自由基清除作用 由圖7可知,當雞骨草多糖濃度在0.2～10.0 mg/mL時,對DPPH自由基清除率不斷增大,當質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL時,雞骨草多糖對DPPH自由基清除率為89.74%,而維生素C對DPPH自由基清除率可達96.03%,雞骨草多糖清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50為1.591 mg/mL,維生素C的IC50為0.623 mg/mL,兩者比較,雞骨草多糖清除能力較弱于維生素C。以上結(jié)果顯示,雞骨草多糖具有較好的DPPH自由基清除作用。

圖7 雞骨草多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of polysaccharide from Abrus cantoniensis Hance on DPPH radical

2.3.2 雞骨草多糖對·OH清除作用 由圖8可知,當雞骨草多糖濃度在0.2～10.0 mg/mL時,對·OH清除率穩(wěn)步提升,而維生素C在濃度6 mg/mL時對·OH清除率就已達到最大值95.27%,之后趨于穩(wěn)定。當質(zhì)量濃度為10 mg/mL時,雞骨草多糖對·OH清除率為88.53%,維生素C對·OH清除率可達95.14%,雞骨草多糖清除·OH的IC50為1.926 mg/mL,維生素C的IC50為0.587 mg/mL,兩者比較,維生素C清除能力強于雞骨草多糖。以上結(jié)果說明,雞骨草多糖具有較好的·OH清除作用。

圖8 雞骨草多糖對·OH的清除作用Fig.8 The scavenging effect of polysaccharide from Abrus cantoniensis Hance on hydroxyl radical

3 討論與結(jié)論

本研究在單因素實驗基礎上,通過響應面優(yōu)化設計,考察了雞骨草多糖纖維素酶酶法提取的工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雞骨草多糖纖維素酶法提取影響因素的主次順序為:酶添加量(C)>液料比(A)>酶解時間(B)>酶解溫度(D),纖維素酶添加量、液料比和酶解時間對雞骨草多糖得率影響極顯著(p<0.001),而酶解溫度對多糖提取得率影響顯著(p<0.05);雞骨草多糖最佳酶解提取條件為液料比13∶1 mL/g,酶解時間60 min,酶添加量12.8 mg/mL,酶解溫度 50 ℃,pH為5.0,在此最佳工藝條件下,雞骨草多糖得率為8.15%,與回歸模型方程預測值8.34%相比,相對誤差小于5%。吳功慶等[7]使用超聲波輔助水提醇沉法提取雞骨草多糖,獲得的多糖得率為6.4%。徐淑慶等[11]利用熱水浸提法提取雞骨草多糖,在料液比為1∶40 g/mL,提取溫度80 ℃,提取時間60 min的工藝條件下,多糖提取率為5.39%。韋坤華等[12]研究發(fā)現(xiàn),在解析劑7 mL/g,微波功率560 W,微波時間90 s,液料比40∶1 mL/g,磁力攪拌速度1950 r/min,提取溫度80 ℃,提取時間40 min的工藝條件下,雞骨草多糖得率可達5.43%,微波預處理法相比水提醇沉法可顯著縮短提取時間。以上提取方法獲得的雞骨草多糖得率均低于本研究中所使用的纖維素酶法提取,且酶法提取溫度50 ℃明顯低于傳統(tǒng)水提及微波法的80 ℃,提取溫度低在天然產(chǎn)物多糖成分活性保持及節(jié)能方面具有一定的優(yōu)勢。此外,本研究使用的酶法提取有機溶劑用量少,且不需要超聲波發(fā)生器等設備。