枯草芽孢桿菌發(fā)酵提取物對大腸桿菌的抑制作用

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(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院,浙江寧波 315100)

隨著人們食品安全意識的增強(qiáng),傳統(tǒng)的化學(xué)防腐劑已不能滿足人們的需求,開發(fā)新型天然防腐劑已成為食品添加劑發(fā)展的主要方向之一。在微生物天然防腐劑中,研究最多的是乳酸鏈菌肽(Nisin)和納他霉素(Natamycin),也是目前我國允許使用的兩種天然生物保鮮劑。但是Nisin抑菌譜相對較窄,僅對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出顯著抑制作用,不能抑制革蘭氏陰性菌和真菌。Natamycin僅能有效殺滅霉菌、酵母菌和絲狀真菌,而對細(xì)菌無效。因此，研究開發(fā)安全、廣譜、高效的微生物天然防腐劑和保鮮劑具有重要意義。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)廣泛分布于自然界中,產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)是其發(fā)揮生物防治功能的重要機(jī)制之一?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)主要有兩大類:核糖體合成的抗菌蛋白和抗菌肽以及非核糖體合成的脂肽類化合物[1-3]?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的活性代謝物質(zhì)抗菌譜廣,對植物病原菌、食品腐敗菌、致病菌等有明顯的抑制作用,同時(shí)也表現(xiàn)出抗氧化等功能,是極具潛力的微生物天然食品防腐劑[4-5]。目前對枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)的研究較多,主要集中在抗菌物質(zhì)分離鑒定、抑菌活性等[6-8],抑菌機(jī)制涉及較少。此外,不同枯草芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)有較大差異,即使同一菌株,發(fā)酵條件改變也會導(dǎo)致抗菌物質(zhì)有偏差,因此開展特定菌株的抗菌物質(zhì)的篩選及活性研究,對正確利用相關(guān)菌株具有重要意義。

本文以革蘭氏陰性菌大腸桿菌為目標(biāo)菌,對枯草芽孢桿菌WL17發(fā)酵抗菌物質(zhì)成分及其對大腸桿菌的抑菌機(jī)理進(jìn)行初步研究,以期為科學(xué)開發(fā)和利用枯草芽孢桿菌及其抑菌物質(zhì)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LB液體培養(yǎng)基、Hank’s溶液 北京索萊寶科技有限公司;二乙酸熒光素、鈣離子熒光探針Fluo-3/AM 美國 Sigma公司;牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-谷氨酸鈉、二甲基亞砜等 均為分析純;大腸桿菌(E.coli)ATCC25922、枯草芽孢桿菌WL17 由實(shí)驗(yàn)室分離得到;種子培養(yǎng)基配方:牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、酵母膏5 g、葡萄糖5 g、蒸餾水1L,pH7.0～7.4;發(fā)酵培養(yǎng)基配方:葡萄糖20 g、MgSO40.5 g、L-谷氨酸鈉5 g、KCl 0.5 g、KH2PO41.0 g、FeSO40.15 mg、MnSO45.0 mg、CuSO40.16 mg、蒸餾水1L,pH7.2～7.4。

H-7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司;S-3400N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司;F-380熒光分光光度計(jì) 天津港東科技發(fā)展有限公司;754型紫外可見分光光度計(jì) 上海菁華科學(xué)儀器有限公司;LC-6AD半制備液相色譜儀 日本島津公司;LCQ Advantage電噴霧質(zhì)譜儀 美國Finnigan公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵提取物的制備 取枯草芽孢桿菌斜面菌種到種子培養(yǎng)基中,37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)18 h后,按3%的接種量接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,30 ℃、160 r/min,發(fā)酵培養(yǎng)38 h。發(fā)酵液在4 ℃下8000 r/min離心15 min去菌體得到上清液,上清液用6 mo1/L的HCl調(diào)pH為2.5,4 ℃下沉淀1 h。然后離心(4 ℃,10000 r/min)15 min,收集沉淀物,用70%甲醇提取三次,收集提取液將其pH調(diào)為中性,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥得到枯草芽孢桿菌發(fā)酵提取物(BsFE)。

1.2.2 BsFE最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用液體倍比稀釋法測定BsFE對大腸桿菌的最小抑菌濃度[9]。將BsFE用LB液體培養(yǎng)基倍比稀釋為0.196、0.393、0.492、0.614、0.768、0.96、1.2、1.5 mg/mL濃度范圍,取對數(shù)生長期的大腸桿菌分別接種到不同BsFE濃度的LB培養(yǎng)基中,接種菌落數(shù)為1×105cfu/mL,同時(shí)設(shè)置空白對照組(不加BsFE,接種)和陰性對照組(不加BsFE,不接種)。各試管于37 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)18 h后，觀測大腸桿菌的生長情況,并進(jìn)行固體平板培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[10],計(jì)算菌落總數(shù),以大腸桿菌不生長的最小稀釋度對應(yīng)的BsFE含量為MIC值。

1.2.3 BsFE對大腸桿菌生長曲線的影響 取大腸桿菌斜面菌種到種子培養(yǎng)基中,37 ℃、160 r/min培養(yǎng)18 h作種子培養(yǎng)液,然后按3%的接種量分別接種于6組含有50 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,放置于37 ℃、160 r/min的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。組1(空白組):接種同時(shí)添加1 mL無菌蒸餾水;組2(延滯期):接種同時(shí)添加BsFE使其濃度為1MIC;組3、組4(對數(shù)期):培養(yǎng)5 h后添加BsFE使其最終濃度分別為1MIC、2MIC;組5、組6(穩(wěn)定期):培養(yǎng)10 h后添加BsFE使其最終濃度分別為1MIC、2MIC。6組分別于培養(yǎng)的0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24、36、48 h取樣測OD600值,制作生長曲線。

利用殺菌率考察BsFE對大腸桿菌的抑菌效果,公式如下:

殺菌率(%)=(對照OD600值-試驗(yàn)組OD600值)/對照OD600值×100

1.2.4 BsFE對大腸桿菌細(xì)胞通透性的影響 取對數(shù)生長期的大腸桿菌菌液離心(8000 r/min,5 min)收集菌體,用Hank’s溶液洗滌三次,制成濃度為1×105cfu/mL的菌懸液,分別向其加入BsFE,使其最終濃度分別為0、1MIC、2MIC和3MIC。于37 ℃、160 r/min條件下,孵育2 h,離心(8000 r/min,5 min)收集菌體,菌體用Hank’s溶液洗滌三次。然后分別向菌懸液中添加二乙酸熒光素丙酮溶液和Fluo-3/AM二甲基亞砜溶液,兩者終濃度分別為0.25 mg/mL和5 μmol/L。添加二乙酸熒光素的菌懸液振蕩均勻,室溫下放置10 min后,進(jìn)行熒光分析測定。添加Fluo-3/AM試劑的菌懸液振蕩均勻后,避光37 ℃下孵育30 min,5000 r/min離心5 min,菌體用Hank’s溶液洗滌三次,進(jìn)行熒光分析測定。參照陳衛(wèi)等[11]方法設(shè)置熒光分析測定條件:Fluo-3/AM:激發(fā)波長405 nm,掃描波長380～430 nm;二乙酸熒光素:激發(fā)波長490 nm,掃描波長460～580 nm。

相對熒光強(qiáng)度(%)=(添加樣品后的熒光強(qiáng)度/空白熒光強(qiáng)度)×100

1.2.5 BsFE對大腸桿菌細(xì)胞顯微特征的影響 取對數(shù)生長期的大腸桿菌種子液,接種到BsFE濃度為1MIC的LB液體培養(yǎng)基中,菌液濃度為1×105cfu/mL。于37 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)3 h后,離心(8000 r/min,5 min)棄上清液,收集細(xì)胞沉淀,并用pH7.2磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次,用2.5%戊二醛固定2 h,然后分別制備掃描電鏡和透射樣品[12-13],并進(jìn)行觀察。

1.2.6 BsFE的分離純化和成分分析 采用Sephadex LH-20柱層析(1 cm×85 cm)對BsFE進(jìn)行分離純化,以70%甲醇作為洗脫液,流速為0.3 mL/min,檢測波長230 nm,每6 min收集一管,按照洗脫峰合并收集液,分別濃縮后冷凍干燥得到BsFE分離組分。選取對大腸桿菌抑菌效果好的組分采用半制備液相色譜儀進(jìn)行分離制備,采用Kromaisl C-18色譜柱(250 mm×10 mm,5 μm),柱溫25 ℃,以乙腈/水(0.1%三氟乙酸)為流動相,進(jìn)樣量150 μL,流速4 mL/min,檢測波長230 nm,按色譜峰收集洗脫液,冷凍干燥后得到不同組分,對各組分進(jìn)行抑菌分析,篩選活性大的組分,利用ESI/MS對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析。ESI/MS條件如下:正離子模式,掃描范圍m/z 100～2000,毛細(xì)管電壓3.5 kV,錐電壓30 V,離子源溫度150 ℃。

1.2.7 BsFE分離組分抑菌能力的測定 參照南楠等[14]方法,將大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期,調(diào)整其菌體濃度為1×105cfu/mL,采用牛津杯雙層平板法測定BsFE分離組分的活性。普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 mL為下層培養(yǎng)基,凝固后加入混有菌液的改良營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂含量為8%)5 mL,即上層培養(yǎng)基。在雙層平板上放置牛津杯,分別添加0.2 mL經(jīng)0.45 μm濾膜過濾的相同濃度的不同組分溶液于牛津杯中,37 ℃培養(yǎng)18～20 h,測定抑菌圈的大小,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,采用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 BsFE最小抑菌濃度(MIC)的測定結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,當(dāng)濃度大于0.614 mg/mL時(shí),接種培養(yǎng)后菌體不變渾濁,BsFE濃度越小,培養(yǎng)液越渾濁,這是因?yàn)闈舛刃∮?.614 mg/mL時(shí)BsFE無法有效抑制菌體的繁殖生長。取0.614 mg/mL附近的濃度進(jìn)行平板培養(yǎng),結(jié)果如表1所示,當(dāng)BsFE濃度小于0.614 mg/mL時(shí),可以觀察到菌落生長,而大于0.614 mg/mL時(shí),無菌落生長,因此BsFE的最小抑菌濃度為0.614 mg/mL。

表1 固體平板法驗(yàn)證BsFE的最低抑菌濃度Table 1 Validation the MIC of BsFE by solid plate method

2.2 BsFE對大腸桿菌生長曲線的影響

分別在大腸桿菌生長的延滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期添加不同濃度的BsFE,結(jié)果如圖1所示。組2于延滯期加入1MIC的BsFE(0 h、1MIC),生長曲線一直保持在較低水平,表明BsFE能夠有效地抑制大腸桿菌的生長,并表現(xiàn)出一定的溶菌作用。組3和組4分別在對數(shù)生長期加入不同濃度的BsFE(5 h、1MIC,5 h、2MIC),其對大腸桿菌的抑菌和溶菌作用明顯,能在短時(shí)間內(nèi)降低其菌體濃度,但添加量對抑菌作用無明顯影響。組5和組6分別在穩(wěn)定期加入不同濃度的BsFE(10 h、1MIC,10 h、2MIC),高濃度(2MIC)下其抑菌和溶菌作用明顯好于低濃度(1MIC)。

圖1 BsFE對大腸桿菌生長曲線的影響Fig.1 Effects of BsFE on E.coli growth curve

2.3 BsFE對大腸桿菌細(xì)胞通透性的影響

經(jīng)BsFE作用的大腸桿菌細(xì)胞染色后的熒光強(qiáng)度變化如圖2所示,染色后的細(xì)胞在512 nm處熒光強(qiáng)度最大,熒光強(qiáng)度隨BsFE濃度的增大而降低,添加1MIC、2MIC、3MICBsFE的相對熒光強(qiáng)度分別為85.3%、75.5%和47.9%。二乙酸熒光素本身不發(fā)熒光,但它能夠穿透細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)的非特異性酯酶水解為熒光素[15-16],當(dāng)細(xì)胞膜受到破壞,膜通透性變大,會導(dǎo)致熒光從胞漿中外漏致使熒光強(qiáng)度下降。因此,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BsFE能夠破壞大腸桿菌細(xì)胞膜的完整性,且濃度越高,破壞程度越大。

圖2 BsFE對大腸桿菌細(xì)胞FDA染色后熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of BsFE on the fluorescence intensity of the E. coli by FDA staining

細(xì)胞膜通透性的變化可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變,采用Fluo-3/AM熒光探針檢測BsFE處理后大腸桿菌細(xì)胞鈣離子濃度的變化,可反映其細(xì)胞膜通透性的變化。對BsFE處理后的大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行Fluo-3/AM負(fù)載,孵育后熒光強(qiáng)度變化如圖3所示,408 nm處熒光強(qiáng)度最大。隨著BsFE濃度的增大,熒光強(qiáng)度不斷增加,經(jīng)1MIC、2MIC和MIC BsFE處理后,相對熒光強(qiáng)度分別達(dá)202%、245%和318%。結(jié)果表明經(jīng)BsFE處理后,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度大幅度增加,即BsFE處理能破壞大腸桿菌細(xì)胞膜的完整性,這與圖2所得結(jié)果相一致。

圖3 BsFE對大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響Fig.3 Effect of BsFE on the calcium concentration in the E. coli cell

2.4 BsFE對大腸桿菌細(xì)胞顯微特征的影響

采用掃描電鏡和透射電鏡觀察BsFE對大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,推斷BsFE作用導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞破裂的情況,結(jié)果如圖4～圖5所示。

圖4 掃描電鏡觀察BsFE對大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of BsFE on the structure ofE. coli under scanning electron microscope注:A:空白組;B:BsFE處理組。

圖5 透射電鏡下BsFE對大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of BsFE on the structure ofE. coli under transmission electron microscope注:A:空白組0.5 μm;B:BsFE處理組0.5 μm; C:BsFE處理組0.2 μm。

掃描電鏡下空白組菌體細(xì)胞飽滿,細(xì)胞輪廓清晰,表面完整光滑,呈現(xiàn)兩端鈍圓的短桿狀,而BsFE作用3 h后,菌體細(xì)胞粗糙,大量菌體表面出現(xiàn)褶皺及凹陷,異常菌體數(shù)量增多,表明BsFE能有效地破壞細(xì)胞表面結(jié)構(gòu),造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變。透射電鏡下空白組菌體細(xì)胞完整光滑,細(xì)胞膜與細(xì)胞壁結(jié)合緊密,細(xì)胞質(zhì)均勻,細(xì)胞整體無缺陷、無斷裂,而BsFE作用3 h后,菌體細(xì)胞邊緣模糊,細(xì)胞壁缺失,細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞質(zhì)大量流失,表明BsFE能導(dǎo)致細(xì)胞膜的破裂,內(nèi)容物泄露,最終致使細(xì)胞死亡。

2.5 BsFE的分離純化和成分分析

BsFE采用Sephadex LH-20柱層析(1 cm×85 cm)分離可得3個(gè)主要組分(S1、S2、S3),選取抑菌活性最強(qiáng)的組分(S3)采用半制備液相色譜進(jìn)行分離制備,可得6個(gè)主要組分(圖6),其中峰Ⅰ、峰Ⅴ和峰Ⅵ對大腸桿菌有抑制作用(表2),故對這三個(gè)組分進(jìn)行了ESI/MS分析(表3),結(jié)果提示BsFE中主要抑菌成分可能是多烯類化合物和脂肽類化合物。1L發(fā)酵液可以獲得組分Ⅰ10.25 mg,組分Ⅴ77.48 mg,組分Ⅵ5.73 mg。

表2 分離組分Ⅰ～Ⅵ抑菌活性的分析Table 2 Antimicrobial activities of componentsⅠ～Ⅵ

圖6 S3的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of S3

表3 分離組分Ⅰ、Ⅴ和Ⅵ的質(zhì)譜分析Table 3 ESI/MS analysis of componentsⅠ,Ⅴ and Ⅵ

3 討論

枯草芽孢桿菌發(fā)酵提取物BsFE對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為0.614 mg/mL。有研究報(bào)道陽離子抗菌肽對革蘭氏陽性菌、陰性菌以及真菌的最低抑菌濃度范圍為0.25～16 μg/mL[17]。黃現(xiàn)青[4]研究發(fā)現(xiàn)BacillussubtilisfmbJ產(chǎn)生的脂肽對大腸桿菌的最低抑菌濃度為468.75 μg/mL。相比較,BsFE的MIC值較高,可能是因?yàn)榭咕镔|(zhì)不同,同時(shí)與試驗(yàn)所用BsFE為混合物有關(guān)?？咕镔|(zhì)的抑菌作用主要有抑菌不溶菌和抑菌并溶菌兩種,前者菌體的生長曲線保持一定的濁度水平,不升高也不下降,后者菌體生長曲線會下降[18]。BsFE對大腸桿菌生長曲線的影響表明BsFE能夠有效地抑制大腸桿菌的生長,并表現(xiàn)出一定的溶菌作用,且在延滯期和對數(shù)期加入BsFE后溶菌作用更明顯。另外,考察BsFE對大腸桿菌的殺菌率發(fā)現(xiàn),在延緩期和對數(shù)生長期加入BsFE后殺菌率分別能達(dá)到80%和60%以上,而在穩(wěn)定期對大腸桿菌的殺菌率較低,僅為40%左右,說明BsFE對低濃度菌體具有更好的殺菌效果。

盧群等[19]在研究中證實(shí)二乙酸熒光素能夠有效的載入活的大腸桿菌細(xì)胞,可以通過熒光強(qiáng)度的變化表征細(xì)胞膜的完整性。Fluo-3/AM在進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)非特異性酯酶脫去AM酯,與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子結(jié)合后，熒光強(qiáng)度增加，且與鈣離子濃度成比例關(guān)系[20],細(xì)胞膜通透性的變化可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)液中鈣離子濃度的改變,因此采用Fluo-3/AM熒光探針檢測可反映細(xì)胞膜通透性的變化。二乙酸熒光素染色法和Fluo-3/AM熒光探針法的試驗(yàn)結(jié)果均表明，BsFE能夠增加大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性,使得大量的熒光素隨細(xì)胞內(nèi)容物泄露出來，且Fluo-3/AM能夠更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。為進(jìn)一步說明BsFE對大腸桿菌菌體細(xì)胞的影響,采用掃描電鏡和透射電鏡觀察BsFE對大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,從而推斷BsFE處理能夠?qū)е麓竽c桿菌細(xì)胞的破裂。由此說明，BsFE能夠通過改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)形態(tài)來影響菌體細(xì)胞的新陳代謝,從而抑制其生長繁殖。BsFE的抗菌作用可能是通過膜結(jié)合性實(shí)現(xiàn)的,膜結(jié)合性抗菌是一種比較被認(rèn)可的抗菌作用模型[21-22],該模型認(rèn)為抗菌物質(zhì)的膜結(jié)合性使其穿透細(xì)胞壁結(jié)合到細(xì)胞膜表面,通過改變膜的通透性或在膜上形成離子通道或進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，致使細(xì)胞死亡。BsFE分離純化后對具有大腸桿菌抑制作用的組分進(jìn)行初步成分分析,與相關(guān)文獻(xiàn)比對[23-27],推測BsFE抑菌活性成分包含多烯類化合物和脂肽類化合物,具體的分子結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步確定。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌發(fā)酵提取物(BsFE)對大腸桿菌具有明顯的抑制作用,在大腸桿菌不同生長期加入BsFE均能取得很好的抑制效果,且延緩期和對數(shù)期的效果優(yōu)于穩(wěn)定期。試驗(yàn)表明BsFE能增加大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性,同時(shí)經(jīng)BsFE作用后的細(xì)胞表面粗糙,邊緣模糊,細(xì)胞膜破裂。BsFE經(jīng)Sephadex LH-20柱和液相制備色譜分離后得到三個(gè)具有抑菌活性的組分,初步成分分析顯示可能是多烯類化合物和脂肽類化合物。本試驗(yàn)結(jié)果為枯草芽孢桿菌及其抑菌物質(zhì)的進(jìn)一步開發(fā)和研究提供了一定理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。