普洱茶揮發(fā)性組分的抗癌、抗炎功能特性

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(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

普洱茶是以地理標志保護范圍內(nèi)的云南大葉種曬青茶為原料,采用特定的加工工藝制成,具有獨特品質(zhì)特征的茶葉[1]。普洱茶因具有抗腫瘤[2]、抑菌[3]、抗氧化[4]、減肥[5]、降血糖[4]等多種功效和獨特的陳香品質(zhì)[6]，而備受研究人員關(guān)注和廣大消費者喜愛。近年來,普洱茶香氣的研究主要集中于成分提取和組成分析。香氣提取的方法主要有同時蒸餾萃取法、頂空固相微萃取法、減壓蒸餾萃取法、超聲波或微波輔助萃取法[7]。劉玲[8]、呂海鵬[9]等研究表明,萜烯類和甲氧基苯類物質(zhì)是普洱茶中最主要的香氣成分。而對其功能特性,僅任洪濤等[10]通過化學(xué)抗氧化法研究發(fā)現(xiàn),普洱茶揮發(fā)性組分具有清除DPPH自由基和Fe3+還原能力。而基于體外細胞系水平的抗癌、抗炎等功能特性的研究尚未見報道。

因此,本研究以云南大葉種加工的普洱茶為材料,采用同時蒸餾萃取法(SDE)初提普洱茶揮發(fā)性組分,進而通過化學(xué)法和薄層層析法(TLC)分離,采用GC-MS分析鑒定這些揮發(fā)性組分的組成和含量,以小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7誘導(dǎo)的高醌還原酶(quinone reductase,QR)活性和小鼠巨噬細胞RAW264.7檢測的高NO抑制率為指標,篩選普洱茶揮發(fā)性組分中具有較強抗癌、抗炎活性的組分。最終采用小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7、人結(jié)腸癌細胞HCT116、人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MDA-MB-231四大癌癥模型和小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥模型分別評價主要揮發(fā)性單體的抗癌、抗炎活性，以期為普洱茶揮發(fā)性組分的功能特性研究及進一步的開發(fā)利用提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南大葉種普洱茶 廣東省茶葉進出口公司;小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7、小鼠巨噬細胞RAW264.7 美國模式培養(yǎng)物儲存庫(ATCC);人結(jié)腸癌細胞HCT116、人肝癌細胞HepG2和人乳腺癌細胞MDA-MB-231 中國科學(xué)院細胞庫;四甲基偶氮唑籃(MTT)、甲萘醌、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、洋地黃皂苷、脂多糖(LPS)、臺盼藍、結(jié)晶紫、二甲基亞砜(DMSO)、1,2,3-三甲氧基苯(≥98%)、1,2,4-三甲氧基苯(≥97%)、1,2-二甲氧基苯(≥99%)、β-紫羅酮(≥97%)、α-松油醇(≥99%)、葉綠醇(≥95%)、植酮(≥97%) Sigma公司;α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素、DPBS Gibco公司;牛血清白蛋白(BSA) 北京普博欣生物科技有限公司;DMEM(無酚紅)培養(yǎng)基 GluMax Hyclone公司;活性炭(分析純) 天津科密歐有限公司;薄層層析板GF254青島譜科試劑有限公司;細胞培養(yǎng)瓶 Nunc公司;Coster 96孔細胞培養(yǎng)板 Corning公司;二氯甲烷、甲醇、吐溫-20、碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸 均為國產(chǎn)分析純。

同時蒸餾萃取裝置 北京百晶生物科技有限公司;薄層色譜展開缸 廣州市叢源儀器有限公司;VersaMax酶標儀BNR 06346 美國Molecular Devices公司;GC-MS-QP 2010 Ultra Shimadzu公司;Centrifuge 5804R離心機 德國Eppendorf公司;CKX31顯微鏡 日本Olympus公司;HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;HH2型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;BT25S電子分析天平 瑞士Mettle Toledo公司;HSC-12B氮吹儀 天津恒奧發(fā)展有限公司;Mili-Q Integral 3超純水機 德國Merk-Milipore公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;2E-170557渦旋混合儀 江蘇麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 SDE法提取普洱茶揮發(fā)性組分 采用SDE法[11],將普洱茶樣品磨碎,過20目篩,稱取50 g,加入320 mL蒸餾水,置于1 L圓底燒瓶中,連接于SDE裝置的一端,用電熱套進行加熱,使水保持沸騰;另一端連接裝有二氯甲烷的圓底燒瓶,恒溫水浴鍋加熱,溫度設(shè)置為50 ℃;兩端同時加熱萃取2 h;富集萃取液,氮氣吹干二氯甲烷,得到普洱茶初提組分,置于-20 ℃保藏備用。

1.2.2 化學(xué)法分離普洱茶初提組分 參照王佐[12]的方法。將1.2.1提取得到的含普洱茶初提組分的二氯甲烷溶液采用化學(xué)法分離,得到普洱茶中性組分、酸性組分和堿性組分。其流程見圖1。

圖1 化學(xué)法分離普洱茶初提組分Fig.1 The isolation procedures of volatile components in Pu-erh tea by chemical method

1.2.3 薄層層析法分離普洱茶中性組分及F6組分 在通過SDE法初提、化學(xué)法分離的基礎(chǔ)上,本研究用薄層層析硅膠板GF254對同時具有抗癌、抗炎活性的普洱茶中性組分進行進一步分離。將1.2.2處理得到的中性組分溶于二氯甲烷中,毛細管點樣,用含0.3%甲醇的二氯甲烷溶液作展開劑,在層析缸中展開至薄層板頂部約1 cm處取出,紫外燈下觀察并標出條帶區(qū),共6條,標記為F1、F2、F3、F4、F5和F6,分條帶刮下硅膠粉,溶于二氯甲烷,靜置10 h左右,吸取上清液,氮氣吹干二氯甲烷,置于-20 ℃保藏備用，將具有較強抗癌活性的F6組分按照中性組分的薄層層析條件進行分離，得到F6-1，F(xiàn)6-2，F(xiàn)6-3，F(xiàn)6-4，置于-20 ℃保藏備用。

1.2.4 GC-MS分析條件 參照王佐[12]的方法,將通過細胞模型篩選到的抗癌或抗炎功能較強的初提組分、中性組分、F6、F6-2組分進行GC-MS分析。將各色譜峰通過人工解析和計算機檢索(NIST圖譜庫)進行定性分析,用面積歸一法進行定量分析,以各組分的峰面積占總峰面積的百分比表示組分的相對含量。

GC條件:HP-INNOWAax彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度為230 ℃;載氣為高純氦氣,純度>99.999%,流速2 mL/min;起始柱溫40 ℃,保持2 min,以3 ℃/mim升至110 ℃,保持2 min,以5 ℃/min升至170 ℃,保持2 min,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持1 min,不分流進樣。

MS條件:離子源EI,電子能量為70 eV,電子倍增器電壓350 V,質(zhì)量掃描范圍35～335 m/z。

1.2.5 普洱茶初提組分及其分離組分抗癌、抗炎活性評價 參照王佐[12]的方法。小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7經(jīng)解凍復(fù)蘇后,培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基為89%的α-MEM培養(yǎng)基、10%的胎牛血清(55 ℃熱處理)、1%青霉素(100 U/mL)/鏈霉素(100 μg/mL)。胰蛋白酶消化細胞,每隔3～4 d繼代一次。

小鼠巨噬細胞RAW264.7經(jīng)解凍復(fù)蘇后,培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基為88%不含酚紅的DMEM高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%青霉素(100 U/mL)/鏈霉素(100 μg/mL)和1% GlutaMAX添加劑。用細胞刮刀刮下細胞,每隔2～3 d繼代一次。

1.2.5.1 抗癌活性評價 QR是二相解毒酶的一種,小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7誘導(dǎo)QR活性的模型被廣泛應(yīng)用于抗癌活性物質(zhì)的篩選。參照Prochaska[14]的方法。取Hepa1c1c7細胞接種于96孔板,2.5×104個/mL,每孔200 μL,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;棄去舊培養(yǎng)液,每孔添加150 μL溶于含0.5% DMSO培養(yǎng)基的普洱茶初提組分或其分離組分(樣品濃度選擇在使Hepa1c1c7細胞活力>0.5的濃度范圍內(nèi))。加樣后繼續(xù)培養(yǎng)48 h;棄去舊培養(yǎng)液,每孔加50 μL洋地黃皂苷(含2 mmol/L EDTA溶液),37 ℃恒溫搖床振蕩40 min;每孔加200 μL QR酶液,測定490 nm波長下10 min內(nèi)吸光值變化的動力學(xué)曲線,計算QR活性。另備一96孔板,按同樣方法接種細胞和加樣,培養(yǎng)48 h后棄掉舊培養(yǎng)液,結(jié)晶紫溶液染色15 min,棄去;SDS(0.5%)溶解1 h,用酶標儀測定610 nm吸光值,計算細胞活力。

以細胞活力(cell viability,CV)>0.5,相對QR活性≥2,作為樣品具有QR誘導(dǎo)活性的篩選指標。將相對QR活性=2時,對應(yīng)的樣品濃度定義為CD值,CD值越小,抗癌活性越強。

1.2.5.2 抗炎活性評價 NO是機體炎癥反應(yīng)中的重要的促炎因子之一,限制過量的NO生成是抑制炎癥反應(yīng)的重要指標之一。參照Wang等[15]和Hsieh等[16]的方法。取RAW264.7細胞接種于96孔板中,5×105個/mL,每孔200 μL,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;棄掉舊培養(yǎng)液,添加溶于含0.5% DMSO培養(yǎng)基的普洱茶初提組分或其分離組分(樣品濃度設(shè)置在使RAW264.7細胞活力>50%的濃度范圍內(nèi)),再添加100 μL LPS(終濃度為1 μg/mL),混勻,繼續(xù)培養(yǎng)24 h;取出96孔板,每孔吸取100 μL上清液轉(zhuǎn)移至新96孔板中,加入等體積Griess試劑,反應(yīng)10 min,酶標儀測定542 nm處吸光值,計算NO抑制率。將舊96孔板中剩余培養(yǎng)液棄掉,每孔加100 μL MTT溶液(0.05 μg/mL),置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,小心吸去MTT溶液,每孔加入200 μL DMSO溶液,37 ℃恒溫搖床振蕩15 min,酶標儀測定550 nm處吸光值,計算細胞活力。以細胞活力>50%,NO抑制率≥50%,作為樣品具有抗炎活性的篩選指標。

人結(jié)腸癌細胞HCT116、人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MDA-MB-231培養(yǎng)參照Mosmann[13]的方法。經(jīng)解凍復(fù)蘇后,培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基為89%的DMEM培養(yǎng)基(含酚紅)、10%胎牛血清及1%青霉素(100 U/mL)/鏈霉素(100 μg/mL)。胰蛋白酶消化細胞,每隔2～3 d繼代一次。MTT比色法參照Mosmann[13]的方法。取人結(jié)腸癌細胞HCT116、人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MDA-MB-231,接種于96孔板中,5×104個/mL,每孔100 μL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;取出培養(yǎng)板,棄掉舊培養(yǎng)液,添加不同濃度的單體(濃度設(shè)置為800、600、400、200、100、50 μg/mL),每孔100 μL,混勻后繼續(xù)培養(yǎng)24 h;取出培養(yǎng)板,吸去舊的培養(yǎng)液,每孔添加100 μL含0.25 mg/mL MTT的新鮮培養(yǎng)液(不含血清),置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h;吸去舊培養(yǎng)液,每孔添加DMSO液體200 μL,置于37 ℃的恒溫搖床中振蕩15 min;15 min后取出培養(yǎng)板,550 nm波長下測定吸光值,計算細胞增殖抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗平行3次,重復(fù)2～3次,采用Origin 9.0擬合計算細胞增殖抑制率的IC50值、NO抑制率的IC50值以及CD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶初提組分的抗癌、抗炎活性

為探究普洱茶揮發(fā)性組分的抗癌、抗炎活性,本研究采用SDE法初提普洱茶揮發(fā)性組分,通過小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7模型測定誘導(dǎo)QR活性和小鼠巨噬細胞RAW264.7模型測定NO抑制率,結(jié)果如圖2～圖3所示。

圖2 普洱茶揮發(fā)性初提組分誘導(dǎo)QR活性Fig.2 QR inducing activity of crude aroma extracted from Pu-erh tea

圖3 普洱茶揮發(fā)性初提組分NO抑制率Fig.3 NO inhibitory activity of crude aroma extracted from Pu-erh tea

從圖2可知,普洱茶揮發(fā)性初提組分在樣品濃度為6.25～50.00 μg/mL范圍內(nèi),小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7的細胞活力>0.5,相對QR活性隨樣品濃度的增加而增大,通過Origin擬合,得到其CD值為28.07 μg/mL,說明其具有抗癌活性。

普洱茶揮發(fā)性初提組分在樣品濃度為12.5～200.0 μg/mL內(nèi),小鼠巨噬細胞RAW264.7的細胞活力>50%。由圖3可知,NO抑制率隨樣品濃度的增加而增大,通過Origin擬合,得到其IC50值為51.68 μg/mL,表明其具有抗炎活性。

再舉一個例子 ，“the dog that will fetch a bone will carry a bone”，當它被翻譯成中文時，狗和骨頭不能按字面翻譯，所以需要翻譯其隱含義：“說別人壞話的人，也會說你的壞話”。

上述結(jié)果表明,普洱茶揮發(fā)性初提組分在樣品濃度<51.68 μg/mL時,同時具有抗癌和抗炎活性。

2.2 普洱茶揮發(fā)性初提組分化學(xué)分離產(chǎn)物的抗癌、抗炎活性

為進一步追蹤抗癌、抗炎活性組分,本研究進而采用化學(xué)法分離普洱茶SDE初提揮發(fā)性組分,得到中性、酸性和堿性組分,其誘導(dǎo)QR活性和抑制NO的結(jié)果如圖4～圖5所示。

圖4 普洱茶中性、酸性、堿性組分誘導(dǎo)QR活性Fig.4 QR inducing activity of neutral,acid and alkaline components isolated from Pu-erh tea注:A;中性組分;B:酸性組分;C:堿性組分。

圖5 普洱茶中性、酸性、堿性組分對RAW264.7細胞NO抑制率的影響 Fig.5 The NO inhibitory activity of neutral,acid and alkaline components isolated from Pu-erh tea evaluated by RAW264.7 cell model注:A:中性組分;B:酸性組分;C:堿性組分。

從圖4結(jié)果可知,普洱茶中性分離組分在3.125～50.000 μg/mL的樣品濃度范圍內(nèi),小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7的細胞活力>0.5,相對QR活性隨樣品濃度的增加而增大,其CD值為45.31 μg/mL,表明其具有較強的抗癌活性。普洱茶酸性和堿性分離組分,在3.125～50.000 μg/mL的樣品濃度范圍內(nèi),未能誘導(dǎo)QR活性倍增。將其最高濃度擴大1倍,即在100 μg/mL條件下,雖然小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7的細胞活力>0.5,但其相對QR活性仍小于2,表明普洱茶酸性、堿性組分在此濃度范圍內(nèi),未顯示抗癌活性。

普洱茶化學(xué)法分離的中性、酸性和堿性組分在樣品濃度為12.5～200.0 μg/mL的范圍內(nèi),小鼠巨噬細胞RAW264.7的細胞活力均>50%。由圖5可知,中性組分抑制NO的IC50值為73.32 μg/mL,酸性組分為151.92 μg/mL,但堿性組分的NO抑制率未達到50%。說明中性和酸性分離組分仍保持了較強的抗炎活性,而堿性組分未顯示抗炎特性。

綜上結(jié)果可知,普洱茶揮發(fā)性初提組分經(jīng)化學(xué)法分離的中性、酸性和堿性3種產(chǎn)物中,只有中性組分同時具有誘導(dǎo)QR的抗癌活性和抑制NO的抗炎活性,其CD值為45.31 μg/mL,抑制NO的IC50值為73.32 μg/mL;酸性組分僅具有一定的抗炎活性,而未顯示抗癌活性,其抑制NO的IC50值為151.92 μg/mL;而堿性組分在實驗濃度范圍內(nèi),均未顯示抗癌、抗炎功能活性。

2.3 普洱茶中性組分TLC分離產(chǎn)物抗癌、抗炎活性

通過TLC法對同時具有抗癌、抗炎活性的普洱茶中性組分進行分離,得到F1～F6,對這6個組分進行抗癌功能特性研究,其誘導(dǎo)QR活性的結(jié)果如圖6～圖7所示。

圖6 普洱茶中性組分TLC分離組分對Hepa1c1c7細胞活力的影響Fig.6 Inhibitory effect of components isolated from neutral component of Pu-erh tea by TLC method against Hepa1c1c7 cell growth

圖7 普洱茶中性組分TLC分離組分誘導(dǎo)QR活性Fig.7 QR inducing activities of components isolated from neutral component of Pu-erh tea by TLC method

由圖6～圖7可知，在25～400 μg/mL樣品濃度范圍內(nèi),細胞活力>0.5,F1～F5組分均未能誘導(dǎo)QR活性達到倍增,未顯示抗癌活性;F6組分在25 μg/mL時的相對QR活性>2,具有較強的抗癌活性。進一步研究,由圖8可知,通過Origin擬合,得到其CD值為12.8 μg/mL,表明此分離組分的抗癌活性強于初提和中性揮發(fā)性組分。

圖8 普洱茶中性組分TLC分離F6組分誘導(dǎo)QR活性Fig.8 QR inducing activities of F6 isolated from neutral component of Pu-erh tea by TLC method

普洱茶中性揮發(fā)性組分TCL分離的6個組分,采用小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥模型分析,在25～400 μg/mL的樣品濃度范圍內(nèi),其細胞活力雖>50%,但NO抑制率均未達到50%的抗炎指標,未顯示抗炎活性(本文未列出)。

在一級TLC分離及抗癌、抗炎功能活性篩選的基礎(chǔ)上,本研究進而選擇具有較強誘導(dǎo)QR活性的F6組分,進行二級TLC分離,經(jīng)紫外觀察發(fā)現(xiàn),其分離出4個組分,命名為F6-1～F6-4。將此4個組分進行抗癌活性測定,其誘導(dǎo)QR活性結(jié)果如圖9～圖10所示。

圖9 普洱茶揮發(fā)性組分F6的TLC分離組分對Hepa1c1c7細胞的增殖抑制作用Fig.9 Inhibitory effect of components isolated from F6 in Pu-erh tea by TLC method against Hepa1c1c7 cell growth

圖10 普洱茶揮發(fā)性組分F6的TLC分離組分誘導(dǎo)QR活性Fig.10 QR inducing activities of components isolated from F6 in Pu-erh tea by TLC method

由圖9～圖10可知,普洱茶揮發(fā)性組分F6二級TLC分離的4個組分,在6.25～200.00 μg/mL的樣品濃度范圍內(nèi),小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7的細胞活力>0.5,4個組分均可誘導(dǎo)QR活性倍增,依CD值由小到大依次為:F6-2:15.12 μg/mL,F6-4:34.12 μg/mL,F6-3:41.35 μg/mL,F6-1:54.51 μg/mL。此結(jié)果說明,這4個二級TLC分離產(chǎn)物均具有抗癌活性,其中F6-2的抗癌活性最強,且與一級TLC分離的F6抗癌活性相當。

2.4 GC-MS分析普洱茶揮發(fā)性組分

在系統(tǒng)追蹤普洱茶揮發(fā)性組分抗癌、抗炎功能活性物質(zhì)的同時,為探究各組分的物質(zhì)組成,本研究采用GC-MS技術(shù),對相關(guān)揮發(fā)性組分的組成和相對含量進行分析鑒定。

2.4.1 普洱茶揮發(fā)性初提組分和中性組分的組成及含量分析 普洱茶揮發(fā)性組分的抗癌、抗炎研究結(jié)果表明,其初提組分和化學(xué)分離的中性組分同時具有較強的抗癌、抗炎活性,對其通過GC-MS進行分析,2個組分的揮發(fā)性物質(zhì)組分種類和含量結(jié)果如表1～表2所示。

由表1可知,普洱茶揮發(fā)性組分的數(shù)量,初提組分共鑒定出99種成分,化學(xué)分離的中性組分共鑒定出93種成分;按照化合物類別,初提和中性揮發(fā)性組分均歸屬于9類,從相對含量由多到少依次為:雜氧化合物、醇類、醛類、酮類、烷烴類、酯類、含氮類、酚類和酸類,表明初提與中性揮發(fā)性組分的化合物類別相對含量占比變化趨勢一致。進而對普洱茶揮發(fā)性初提組分和中性組分中含量≥1%的物質(zhì)組成進行分析,結(jié)果見表2。

表2 普洱茶揮發(fā)性初提組分和中性組分的主要組成(≥1%)Table 2 The main components of crude aroma and neutral component in Pu-erh tea(≥1%)

由表2可知,普洱茶揮發(fā)性初提組分和中性組分相對含量≥1%的成分及相對含量占比變化趨勢完全一致。其中雜氧類主要為1,2,3-三甲氧基苯、1,2-二甲氧基苯和1,2,4-三甲氧基苯;酮類為植酮和β-紫羅酮,醇類為葉綠醇和α-松油醇,醛類為苯甲醛,其中1,2,3-三甲氧基苯在初提組分和中性組分中的相對含量均最高,分別為16.84%和13.54%。

2.4.2 普洱茶TLC分離揮發(fā)性組分的組成及含量分析 普洱茶中性揮發(fā)性組分經(jīng)TLC分離獲得的F6及其二級分離組分F6-2具有較強的抗癌活性,對其通過GC-MS進行的組成和相對含量分析結(jié)果如表3和表4所示。

表4 普洱茶TLC分離揮發(fā)性組分的主要組成(≥5%)Table 4 The main components of TLC products isolated from Pu-erh tea(≥5%)

表3 普洱茶TLC分離揮發(fā)性組分的種類及含量Table 3 The classes and their relative contents of TLC products isolated from Pu-erh tea

由表3可知,從普洱茶中性組分TLC分離的F6組分中共鑒定出78種揮發(fā)性成分,從F6-2組分中共鑒定出67種揮發(fā)性成分。這兩個組分的化合物歸屬于10個類別,除酯類、醇類和其他類物質(zhì)外,其余揮發(fā)性化合物的相對含量和占比變化趨勢均一致。

從表4可知,F6和F6-2作為抗癌活性最強的TLC分離產(chǎn)物,其相對含量≥5%的物質(zhì)主要有,雜氧化合物:1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯等;酮類物質(zhì):植酮、四氫-2,2,6-三甲基-6-乙烯基-3-吡喃酮、4-(2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1-亞基)-2-丁酮等。

2.5 揮發(fā)性單體物質(zhì)的抗癌、抗炎活性

由表5結(jié)果可知,這7種存在于普洱茶中的揮發(fā)性單體物質(zhì)對人結(jié)腸癌細胞HCT116、人肝癌細胞HepG2和人乳腺癌細胞MDA-MB-231都有一定的增殖抑制作用,其中植酮對這3種癌細胞的IC50值皆>800.00 μg/mL,抗癌活性較弱;其余6種單體物質(zhì)對人結(jié)腸癌HCT116細胞的IC50值小于其他兩種細胞的IC50值,即對HCT116細胞的增殖抑制效果最強。β-紫羅酮在7種物質(zhì)中,對4種癌細胞均表現(xiàn)出最強的抗癌活性,其中對Hepa1c1c7細胞的抗癌活性最強,其CD值為17.10 μg/mL。具有抗炎活性的單體為1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯、1,2-二甲氧基苯和β-紫羅酮,抗炎活性由強至弱為:1,2,4-三甲氧基苯:97.11 μg/mL、1,2,3-三甲氧基苯:134.99 μg/mL、β-紫羅酮:152.79 μg/mL、1,2-二甲氧基苯:169.62 μg/mL。綜合可知,3種甲氧基苯類物質(zhì)具有較強的抗炎活性。

表5 揮發(fā)性單體物質(zhì)的抗癌、抗炎活性Table 5 Anti-cancer and anti-inflammatory activities of main monomers in Pu-erh tea

上述研究結(jié)果說明,存在于普洱茶揮發(fā)性組分中的β-紫羅酮是普洱茶發(fā)揮抗癌、抗炎作用的主要物質(zhì)組成之一。前人的研究已證明,β-紫羅酮是一種廣泛存在于天然食物中的類異戊二烯成分[17],能夠抑制多種癌細胞的增殖,具有抗癌、抗炎等多種生物活性。β-紫羅酮作用于前列腺癌細胞PC-3的IC50值為130 μmol/L[18],作用于結(jié)腸癌細胞HCT116的IC50值為60 μmol/L[19],作用于BV2細胞的抗炎活性在17 μmol/L時,抗炎活性的NO抑制率達到50%[20]。

本研究發(fā)現(xiàn),存在于普洱茶揮發(fā)性組分中的1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯、1,2-二甲氧基苯等甲氧基苯類物質(zhì)具有較強的抗炎和一定的抗癌活性。呂海鵬等[9]研究認為:1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯、1,2-二甲氧基苯、4-乙基-1,2-二甲氧基苯等是普洱茶揮發(fā)性成分中獨有的、可區(qū)別于其他茶類的特征性成分。

綜上可知,普洱茶揮發(fā)性組分及其一些單體成分具有抗癌、抗炎功能。但由于普洱茶揮發(fā)性組分種類多樣,組成復(fù)雜,因此深入開展普洱茶不同揮發(fā)性組分間的互作,以及微量高效成分功能特性的研究,能夠更全面、系統(tǒng)、深入揭示普洱茶揮發(fā)性組分的功能特性,讓普洱茶這一特殊茶類更好地造福人類。

3 結(jié)論

本研究的普洱茶揮發(fā)性SDE法初提組分和化學(xué)法分離的中性組分同時具有較強的抗癌、抗炎活性,誘導(dǎo)QR的CD值為28.07、45.31 μg/mL,抑制NO的IC50值為51.68、73.32 μg/mL;GC-MS分析表明,這2類組分的9大類化合物類別相對含量占比變化趨勢一致。

中性組分TLC分離組分中的F6和F6-2具有強的抗癌活性,誘導(dǎo)QR的CD值為12.8、15.12 μg/mL;GC-MS分析表明,其10大類化合物中,除酯類、醇類和其他類物質(zhì)外,其余化合物類別的相對含量和占比變化趨勢均一致,甲氧基苯類和酮類物質(zhì)是其主要的功能活性物質(zhì)。

本研究的7種單體物質(zhì)對人結(jié)腸癌細胞HCT116、人肝癌細胞HepG2和人乳腺癌細胞MDA-MB-231都具有一定的增殖抑制作用,且對人結(jié)腸癌HCT116細胞的增殖抑制作用最強。其中,β-紫羅酮對4種癌細胞均表現(xiàn)出最強的抗癌活性,誘導(dǎo)QR活性的CD值為17.10 μg/mL,抑制HCT116細胞、HepG2細胞和MDA-MB-231細胞增殖的IC50值分別為46.53、325.48和236.34 μg/mL。甲氧基苯類物質(zhì)1,2,4-三甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基苯和1,2-二甲氧基苯皆具有較強的抗炎活性,抑制NO的IC50值分別為:97.11、134.99、169.62 μg/mL。