干酪乳桿菌發(fā)酵液中的主要有機(jī)酸及其抑菌性

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(1.西京學(xué)院醫(yī)學(xué)院,陜西西安 710000; 2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650000; 3.長(zhǎng)春生物制品研究所有限公司,吉林長(zhǎng)春 130000)

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是革蘭氏陽(yáng)性菌,無(wú)孢子,無(wú)鞭毛,不能運(yùn)動(dòng),是發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生酸類(lèi)物質(zhì)的一類(lèi)細(xì)菌的統(tǒng)稱(chēng)。乳酸菌通過(guò)其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,如有機(jī)酸、細(xì)菌素、過(guò)氧化氫等物質(zhì)，抑制病原菌和腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖,從而達(dá)到防腐作用。乳酸、甲酸、乙酸、丙酸等是乳酸菌分泌產(chǎn)生的有機(jī)酸的主要成分,這些有機(jī)酸可以通過(guò)降低微生物生長(zhǎng)環(huán)境體系的pH,達(dá)到抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖的目的,并由此發(fā)揮生物防腐作用[1-2]。在食品行業(yè)中,由于乳酸菌分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有提高食品口感、增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)、延長(zhǎng)保質(zhì)期等優(yōu)點(diǎn),所以食品生物防腐方面具有至關(guān)重要的作用[3]。隨著食品安全問(wèn)題的日益激化,乳酸菌的研究和應(yīng)用越來(lái)越受關(guān)注,希望盡快將乳酸菌應(yīng)用于生物防腐領(lǐng)域,使其不但能解決因食源性病原菌污染食品導(dǎo)致的疾病爆發(fā),同時(shí)也能提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)屬于乳桿菌屬(Lactobacilluas),可發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等多種抑菌物質(zhì)。干酪乳桿菌能夠抑制和殺死食品中的許多腐敗菌及致病菌,可以改善食品特性,不影響食物性狀,且對(duì)食品儲(chǔ)藏過(guò)程中的防腐保鮮也有積極作用[4]。目前,有關(guān)于干酪乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的分離純化和抑菌效果的研究[5-6],但缺乏對(duì)其發(fā)酵液中有機(jī)酸分離與抑菌活性的報(bào)道。本文旨在研究一種干酪乳桿菌發(fā)酵液中有機(jī)酸的有效分離方法,并研究其抑菌活性,為將干酪乳桿菌及其代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)為新型生物防腐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌AS02菌株 為本實(shí)驗(yàn)室從云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉中篩選得到;食源性病原菌大腸桿菌Escherichiacoli(E.coil)O157∶H7菌株、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(S.aureus)、單核細(xì)胞增生李斯特菌Listeriamonocytogenes(L.monocytogenes) 為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株;胰蛋白胨(優(yōu)級(jí)純)、酵母膏(分析純)、牛肉膏(99.5%)、吐溫-80(100%) 英國(guó)OXOID;甲醇(99.9%)、乙腈(99%) 美國(guó)Merck;乳酸(99%)、苯乳酸(99%)、檸檬酸(99%)、乙酸(99%) 德國(guó)Sigma;其他化學(xué)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

MRS肉湯培養(yǎng)基、BHI液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基 根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]方法配制,MRS瓊脂培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂,LB軟瓊脂培養(yǎng)基和BHI軟瓊脂培養(yǎng)基添加0.75%瓊脂。

GHP-9160恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-1B超凈工作臺(tái) 蘇凈安泰公司;ZWY-111C恒溫?fù)u床 上海智誠(chéng)分析儀器有限公司;3-18K高速離心機(jī) SIGMA;YP1002N電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;SX700高壓滅菌鍋 日本TOMY;Ultrospec 2100 pro紫外分光光度計(jì) Amersham Biosciences;AS-600微量pH計(jì) 日本株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 干酪乳桿菌AS02菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)及pH動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) 使用MRS液體培養(yǎng)基將干酪乳桿菌AS02活化后,按1×109CFU/mL接種于MRS培養(yǎng)基中,置于37 ℃靜止培養(yǎng)72 h,每隔2 h取一次樣,在2863×g[9]、4 ℃離心10 min,得到上清和菌體。隨后用0.9%生理鹽水對(duì)菌體進(jìn)行適當(dāng)稀釋,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在600 nm處的吸光度,用麥?zhǔn)媳葷岱ü浪闫渚鋽?shù),利用pH計(jì)測(cè)定并分析培養(yǎng)上清液的pH變化[9]。

1.2.2 干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液的制備 將活化好的干酪乳桿菌AS02菌株按1×109CFU/mL接種于MRS液體培養(yǎng)基,置于37 ℃靜止培養(yǎng),每隔2 h取1 mL菌液離心(2863×g,4 ℃,10 min),取樣至72 h,2863×g,4 ℃離心10 min,取其上清,然后使用0.45 μm超濾膜將其過(guò)濾滅菌,并放置于4 ℃?zhèn)溆肹10]。

1.2.3 干酪乳桿菌AS02發(fā)酵液抑菌活性的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) 采用agar well diffusion(打孔)法[11],將活化的E.coliO157∶H7菌株添加至20 mL LB軟瓊脂培養(yǎng)基中,S.aureus和L.monocytogenes分別添加至20 mL BHI軟瓊脂培養(yǎng)基中,病原指示菌的接種濃度均為106CFU/mL,用直徑為7 mm的打孔器在凝固的培養(yǎng)基中打孔,隨后分別取300 μL AS02菌株培養(yǎng)上清過(guò)濾液,添加至培養(yǎng)基孔內(nèi),對(duì)照組為等量的MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)16 h,測(cè)定抑菌圈直徑,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行。

1.2.4 干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液中有機(jī)酸的分離 使用MRS液體培養(yǎng)基將干酪乳桿菌AS02活化后,按1×109CFU/mL接種于MRS液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃靜止培養(yǎng)48 h,于4 ℃、2863×g離心30 min,棄去菌體沉淀,得到培養(yǎng)上清液,取上清加入蛋白酶K(0.5 μg/mL),30 ℃溫育4 h,再通過(guò)0.45 μm超濾膜超濾,超濾后得到的上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3次,萃取后得到上層乙酸乙酯相、中間層白色絮狀沉淀相和下層水相,對(duì)上層乙酸乙酯相在40～45 ℃,120 r/min條件下進(jìn)行旋蒸濃縮,對(duì)中間層白色絮狀沉淀相在 35～40 ℃、120 r/min條件下進(jìn)行旋蒸濃縮;對(duì)下層水相在60～65 ℃,120 r/min條件下進(jìn)行旋蒸濃縮,以上均按照10倍體積濃縮,濃縮后得到乙酸乙酯相旋蒸相、乙酸乙酯相旋蒸余相、中間相旋蒸相、中間相旋蒸余相、水相旋蒸相和水相旋蒸余相,濃縮后的各相液體置于4 ℃保存[12]。

1.2.5 干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液各萃取相抑菌活性物質(zhì)抑菌試驗(yàn) 采用spot-on-lawn[13]改進(jìn)法對(duì)濃縮后的各相進(jìn)行抑菌試驗(yàn);spot-on-lawn改進(jìn)法的優(yōu)點(diǎn)是為其提供固相支持物,充分考慮抑菌因子分泌的細(xì)胞群體感應(yīng)效應(yīng),并能更加真實(shí)地模擬發(fā)酵環(huán)境,具體步驟如下:吸取5 μL各相,分別滴加于含有106CFU/mL指示菌的25 mL且含0.75%凝膠瓊脂固體平板(E.coliO157∶H7采用LB凝膠瓊脂固體平板,S.aureus和L.monocytogenes采用BHI凝膠瓊脂固體平板)中,將平板先置于4 ℃冰箱中,使各抑菌相均勻擴(kuò)散2 h后,再倒置放入30 ℃的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)20 h(培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度以指示菌而定),后觀察有無(wú)抑菌圈,并測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.6 干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液乙酸乙酯相旋蒸余相中有機(jī)酸組成分析 運(yùn)用HPLC對(duì)干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液乙酸乙酯相旋蒸余相的有機(jī)酸組成進(jìn)行分析,進(jìn)樣量為300 μL,HPLC色譜分析條件為:Waters T3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:0.03 mol/L NH4H2PO4(pH2.45)∶甲醇(95∶5,v/v);進(jìn)樣體積:10 μL;流速:0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;柱溫:30 ℃。

1.2.7 抑菌物質(zhì)對(duì)食源性病原菌細(xì)胞形態(tài)的影響 取干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液乙酸乙酯相旋蒸余相200 μL添加至培養(yǎng)3 h且已接種1×109CFU/mLE.coliO157∶H7的LB培養(yǎng)基和S.aureus的BHI培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min搖床培養(yǎng)15 h,采用添加200 μL生理鹽水于培養(yǎng)3 h,且接種1×109CFU/mLE.coliO157∶H7的LB培養(yǎng)基和S.aureus的BHI培養(yǎng)基做陽(yáng)性對(duì)照。4 ℃,2863×g離心10 min取沉淀,用0.75%生理鹽水洗脫菌體2次,然后用固定液將菌體固定于1.5 mL離心管中,送電鏡室掃描菌體表面結(jié)構(gòu)和透射電鏡觀察病原指示菌的細(xì)胞形態(tài)與內(nèi)部構(gòu)造。

1.2 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行,干酪乳桿菌AS02菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)、pH動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液的抑菌動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)使用圖進(jìn)行表示,干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液各萃取相活性物質(zhì)的抑菌活性數(shù)據(jù)使用表進(jìn)行表示。本實(shí)驗(yàn)使用Excel軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪乳桿菌AS02菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)、pH動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

干酪乳桿菌AS02菌株在發(fā)酵6 h后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,26 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期,培養(yǎng)40 h后,菌落數(shù)開(kāi)始有下降趨勢(shì),但總體變化不大,保持穩(wěn)定趨勢(shì)。該菌株發(fā)酵液的pH在培養(yǎng)6 h后急劇下降,在培養(yǎng)26 h時(shí),pH降至最低值3.6,隨著發(fā)酵延續(xù),pH基本保持穩(wěn)定,見(jiàn)圖1。通過(guò)檢測(cè)干酪乳桿菌AS02菌株維持較高濃度以及較低pH的時(shí)間,為后續(xù)抑菌實(shí)驗(yàn)時(shí)間提供依據(jù)。

圖1 干酪乳桿菌AS02菌株的生長(zhǎng)與pH動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)Fig.1 The dynamic monitoring of growth and pH of Lb. casei AS02 strain

2.2 干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液的抑菌動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液對(duì)EscherichiacoliO157∶H7、Staphylococcusaureus和Listeriamonocytogenes具有不同的抑菌效果。該菌株在培養(yǎng)6 h后,能對(duì)EscherichiacoliO157∶H7發(fā)揮抑菌作用,培養(yǎng)28 h時(shí),抑菌效果最強(qiáng),抑菌圈直徑可高達(dá)32 mm;而該菌在培養(yǎng)10 h后,才開(kāi)始顯示對(duì)Listeriamonocytogenes的抑制作用,培養(yǎng)42 h時(shí)抑菌效果最強(qiáng),其抑菌圈直徑達(dá)到20 mm;在培養(yǎng)14 h后開(kāi)始對(duì)Staphylococcusaureus起到抑制作用,培養(yǎng)36 h時(shí)抑菌效果最強(qiáng),抑菌圈直徑達(dá)到17 mm,見(jiàn)圖2。由此表明,干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液對(duì)EscherichiacoliO157∶H7、Staphylococcusaureus和Listeriamonocytogenes均有較好的抑菌活性。

圖2 干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液的抗食源性病原菌的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果Fig.2 The inhibition ratio of fermentation of Lb. caseiAS02 strain against foodborne-pathogens

2.3 干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液各萃取相活性物質(zhì)的抑菌活性

對(duì)用蛋白酶K處理的干酪乳桿菌AS02發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取后濃縮,以E.coliO157∶H7,S.aureus和L.monocytogenes作為病原指示菌,利用spot-on-lawn改進(jìn)法對(duì)濃縮后的各萃取相進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。表1結(jié)果表明,該干酪乳桿菌的乙酸乙酯相旋蒸余相對(duì)三種食源性病原菌均呈現(xiàn)很好的抑菌效果,它抑制E.coliO157∶H7和L.monocytogenes的生長(zhǎng)最為明顯,抑菌圈直徑分別達(dá)到20.00、21.67 mm。水相旋蒸余相也顯示出抑菌效果,表明該相中也含有相應(yīng)的抑菌活性物質(zhì),這是因?yàn)橐宜嵋阴儆诘蜆O性有機(jī)溶劑,不同極性的抑菌物質(zhì)可能不完全溶于該溶劑中。

表1 干酪乳桿菌AS02萃取相對(duì)食源性病原菌的抑菌效果(mm)Table 1 The anti food-borne pathogens effect of extraction phase of Lb.casei AS02(mm)

2.4 干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液乙酸乙酯相旋蒸余相抑菌物質(zhì)的組成分析

因乙酸乙酯相旋蒸余相對(duì)三種食源性病原菌均呈現(xiàn)很好的抑菌效果,故使用HPLC對(duì)其成分進(jìn)行分析。由表2可知,乙酸乙酯相旋蒸余相中主要有機(jī)酸成分為乳酸、乙酸和苯乳酸,丙酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸的含量較少。劉冬梅等[14]利用HPLC對(duì)Lactobacillusrhamnosus所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)乳酸是主要的抑菌物質(zhì)。張忠華等[15]建立了LactobacillusparaplantarumAY01發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)苯乳酸高效液相色譜法快速檢測(cè)方法。另?yè)?jù)報(bào)道,不同弱酸混合使用可強(qiáng)化抑菌作用,如乳酸和乙酸混合作用的抑菌能力大于等量的2種酸單獨(dú)作用[16]。李潔等[9]利用HPLC對(duì)乳酸片球菌發(fā)酵液進(jìn)行抑菌物質(zhì)分析,發(fā)現(xiàn)主要抑菌物質(zhì)為有機(jī)酸,包括乳酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、丙酸和乙酸。

表2 干酪乳桿菌AS02菌株培養(yǎng)液乙酸乙酯相旋蒸余相有機(jī)酸組分含量Table 2 The content of organic acid components of ethyl acetate phase derived from Lb. casei AS02 strain

2.5 抑菌物質(zhì)對(duì)食源性病原菌生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

通過(guò)掃描電鏡對(duì)E.coliO157∶H7與S.aureus菌體表面進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中病原菌菌體表面有明顯的差異性,正常生長(zhǎng)狀態(tài)的病原菌菌體表面光滑、無(wú)空洞現(xiàn)象;經(jīng)抑菌物質(zhì)處理后的病原菌菌體表面有黏絲狀物質(zhì)出現(xiàn),菌體表面有褶皺并伴隨有空洞,如圖3。

通過(guò)透射電鏡對(duì)E.coliO157∶H7與S.aureus菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),正常生長(zhǎng)的病原菌菌體細(xì)胞膜與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)均勻、完整;經(jīng)抑菌物質(zhì)處理后的病原菌菌體細(xì)胞壁向內(nèi)折疊,細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間空間增加,滲透能力增強(qiáng),內(nèi)壁濃縮并擠壓細(xì)胞內(nèi)溶物,致使細(xì)胞壁出現(xiàn)裂口,內(nèi)溶物流出致死,如圖3,結(jié)果表明,有機(jī)酸對(duì)病原菌的作用機(jī)理與已報(bào)到的一致[17-18]。

圖3 電鏡分析干酪乳桿菌AS02菌株發(fā)酵液抑菌物質(zhì)處理后的食源性病原菌Fig.3 Electron microscope analysis of pathogenic bacteria which were treatmented with antibacterial substances of Lb. casei AS02 注:A1:E. coli O157∶H7對(duì)照組(掃描電鏡,8000×);A2:E. coli O157∶H7實(shí)驗(yàn)組(掃描電鏡,8000×);A3:E. coli O157∶H7對(duì)照組(透射電鏡,50000×);A4:E. coli O157∶H7實(shí)驗(yàn)組(透射電鏡,50000×);B1:S.aureus對(duì)照組(掃描電鏡,250000×);B2:S.aureus實(shí)驗(yàn)組(掃描電鏡,250000×);B3:S.aureus對(duì)照組(透射電鏡,50000×);B4:S.aureus實(shí)驗(yàn)組(透射電鏡,50000×)。

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)干酪乳桿菌AS02菌株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)和pH動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),在發(fā)酵6 h后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,26 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期,培養(yǎng)40 h后,菌落數(shù)開(kāi)始有下降趨勢(shì)。該菌株發(fā)酵液的pH在培養(yǎng)6 h后急劇下降,在26 h時(shí),pH降至最低值3.6,隨著發(fā)酵延續(xù),pH基本保持穩(wěn)定。該菌株在培養(yǎng)6 h后,能對(duì)大腸桿菌O157∶H7發(fā)揮抑菌作用,證明干酪乳桿菌AS02菌株在培養(yǎng)6 h后開(kāi)始大量產(chǎn)生有機(jī)酸。徐靜等[19]研究表明,篩選的2株干酪乳桿菌在開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)菌體密度增加迅速,大約在14 h左右達(dá)到最大,pH隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低,24 h后pH降至4左右。Rathore等[20]研究表明,植物乳桿菌NCIMB 8826在發(fā)酵6 h后生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期,24 h后細(xì)胞濃度開(kāi)始下降,pH在前4 h迅速降低,隨后降低速度減緩,24 h后,pH降至最低值3.5,達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

干酪乳桿菌AS02發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌三種食源性致病菌均呈現(xiàn)很好的抑菌效果。而Palacios等[6]報(bào)道的Lb.casei705的代謝產(chǎn)物僅對(duì)L.monocytogenes具有抑菌作用。雷霞等[5]對(duì)篩選的兩株干酪乳桿菌的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),表明兩株菌除能有效地抑制革蘭氏陽(yáng)性菌枯草桿菌、單核增生李斯特菌外,還可抑制革蘭氏陰性的大腸桿菌K88,但不能抑制大腸桿菌O157。Corsetti等[21]報(bào)道的Lb.sanfranciscoCB1產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可抑制多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。表明干酪乳桿菌AS02發(fā)酵液抑菌物質(zhì)具有較廣泛的抑菌效果。

在乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌物質(zhì)分離純化中,一般使用硫酸銨沉淀法[22-26]、超濾法、疏水層析、離子交換色譜、高效液相色譜和凝膠色譜法,雖然方法簡(jiǎn)單易行,但只能分離蛋白質(zhì)類(lèi)細(xì)菌素。本研究首次使用乙酸乙酯法萃取發(fā)酵液中的有機(jī)酸,方法簡(jiǎn)單。通過(guò)HPLC分析,主要的有機(jī)酸為乳酸、乙酸和苯乳酸,而丙酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸的含量較少。對(duì)萃取液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)表明,抑制E.coliO157∶H7和L.monocytogenes的生長(zhǎng)最為明顯,抑制S.aureus較為明顯。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)乳酸菌分泌產(chǎn)生一種新型生物防腐劑苯乳酸,能夠抑制多種引起食物腐敗的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌[27]。Dieuleveux[28]發(fā)現(xiàn)G.candidum發(fā)酵液對(duì)L.monocytogenes具有很強(qiáng)的抑菌作用,經(jīng)超濾、離心分離色譜、薄層色譜、凝膠過(guò)濾,確定苯乳酸是主要的抑菌物質(zhì)。袁景環(huán)等[17]研究發(fā)現(xiàn),苯乳酸能有效抑制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌的生長(zhǎng),對(duì)熒光假單胞菌和金黃色葡萄球菌有殺滅作用,并具有一定的溶菌性。李潔等人[9]利用HPLC對(duì)乳酸片球菌發(fā)酵液進(jìn)行抑菌物質(zhì)分析,發(fā)現(xiàn)主要抑菌物質(zhì)為有機(jī)酸,包括乳酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、丙酸和乙酸,對(duì)大腸桿菌O157∶H7的抑制活性高于金黃色葡萄球菌YM2-3。

用萃取的有機(jī)物分別抑制E.coliO157∶H7和S.aureus,掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)病原菌菌體表面有黏絲狀物質(zhì)出現(xiàn),菌體表面有褶皺并伴隨有空洞;透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)病原菌菌體細(xì)胞壁向內(nèi)折疊,細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間空間增加,滲透能力增強(qiáng),內(nèi)壁濃縮并擠壓細(xì)胞內(nèi)溶物,致使細(xì)胞壁出現(xiàn)裂口,內(nèi)溶物流出致死。袁景環(huán)等[17]研究了苯乳酸對(duì)金黃色葡萄球菌的作用機(jī)理,表明苯乳酸作用后指示菌嚴(yán)重變形,部分細(xì)胞壁破壞,細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞質(zhì)流出。Crist等[29]認(rèn)為乳酸和乙酸可以酸化細(xì)胞質(zhì),引起質(zhì)子動(dòng)力受到阻礙,細(xì)胞新陳代謝迅速降低,使細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢甚至死亡。Roe等[18]研究發(fā)現(xiàn),乙酸能導(dǎo)致細(xì)菌胞內(nèi)蛋氨酸合成受阻,使細(xì)菌生長(zhǎng)受阻。

本研究表明,對(duì)用蛋白酶K處理的干酪乳桿菌AS02發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯相旋蒸余相對(duì)大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌三種食源性致病菌均呈現(xiàn)很好的抑菌效果,抑制E.coliO157∶H7和L.monocytogenes的生長(zhǎng)最為明顯,分別達(dá)到20.00、21.67 mm。對(duì)乙酸乙酯相旋蒸余相使用HPLC進(jìn)行分析表明,主要有機(jī)酸成分為乳酸、乙酸和苯乳酸,丙酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸的含量較少。乙酸乙酯萃取法簡(jiǎn)單高效,為研究乳酸菌抑菌物質(zhì)提供了一種新手段。乳酸菌在生物防腐中起著重要作用,隨著食品安全問(wèn)題日益受重視,希望通過(guò)生物工程技術(shù),將其早日應(yīng)用于生物防腐領(lǐng)域。