茶粕多糖純化及其理化特性、抗氧化和抑菌活性

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(1.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程系,浙江杭州 310014; 2.中國林業(yè)科學(xué)院亞熱帶林業(yè)研究所,浙江杭州 311400)

山茶籽經(jīng)過冷榨、超臨界CO2或溶劑浸提等技術(shù)提取油脂后,剩下的部分即為山茶籽粕。山茶籽除了能夠提取山茶籽油以外,剩下的山茶籽粕還含有許多的生物活性物質(zhì),如茶多糖、茶皂素、蛋白質(zhì)、生物堿、茶多酚等。而茶多糖作為茶葉、茶籽、茶花等茶作物及其相關(guān)產(chǎn)物中的一種重要化合物,具有顯著降低血糖、提高免疫活性、抗腫瘤和抗氧化等功效[1]?，F(xiàn)階段茶多糖加工制備常采用凝膠柱層析法和纖維素陰離子交換柱層析法[2]。Wei等[3]用水提法提取了茶籽多糖,通過分離純化得到了三種不同的組分,研究了其化學(xué)組成、分子量和生物活性，在研究中發(fā)現(xiàn)，茶籽多糖能夠有效地抑制K562癌細胞的生長,同時還能促進小鼠脾淋巴細胞的增殖。郭紅艷[4]通過水提法從餅粕中獲得茶葉籽多糖,發(fā)現(xiàn)在濃度達到5 mL/mol時,其具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,最高抑制率達82.28%,比茶葉、茶花中提取的多糖抑制效果高很多。國內(nèi)外對茶多糖的研究較多,但是主要集中于多糖的提取和單糖組成分析,鮮見關(guān)于茶多糖的抗氧化性和生物活性的研究。

茶粕多糖(Tea seed cake polysaccharide,TSCP)作為一種重要的提取物和活性多糖,具有極高的研究和應(yīng)用價值。而茶粕多糖的功能活性與其組成、結(jié)構(gòu)、構(gòu)象等因素有關(guān),因此對其進行分離并對其結(jié)構(gòu)和活性進行研究,對于茶粕多糖的開發(fā)利用具有指導(dǎo)意義。本研究對熱水浸提的茶粕多糖進行進一步的分離純化,并且對比研究了粗多糖和純化組分的化學(xué)組成、初步結(jié)構(gòu)、抗氧化性及抑菌性,為其進一步的開發(fā)利用提供了重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂山茶籽粕 浙江劉家香食品有限公司;甲醇、乙醇、苯酚、濃硫酸、30% H2O2、3,5-二硝基水楊酸、葡萄糖、正丁醇、三氯甲烷、過硫酸鉀、醋酐、硼氫化鈉、冰乙酸、溴化鉀、氯化鈉、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂均為分析純,DPPH、ABTS、D-葡萄糖醛酸(≥98%)、三氟乙酸 阿拉丁試劑(上海)有限公司;考馬斯亮藍 上海綠鳥科技發(fā)展有限公司;鄰二氮菲 天津市福晨化學(xué)試劑廠;牛血清白蛋白(≥96%) 上海伯奧生物科技有限公司;透析袋(500 Da),間羥基聯(lián)苯(85%),D-葡萄糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖等6種單糖標(biāo)準(zhǔn)品(≥99%) 美國Sigma公司;大腸埃希氏菌CICC 10.389、金黃色葡萄球菌CICC 21600、枯草芽孢桿菌CICC 10275 中國微生物菌種保藏管理中心。

QT-80FC-LCD型智能自動部份收集器 上海琪特分析儀器有限公司;XK 26 mm×100 cm DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱 美國GE公司;Sephadex-G25 Amersham Pharmacia Biotech;Nicolet 6700型FTIR紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司;Trace1300/ISQ型氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Thermo Scientific公司;TU-1900型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;ALPHA 2-4LD型真空冷凍干燥機 德國Marin Christ公司;PHS-3C型酸度計 杭州奧立龍儀器有限公司;YXQ-LS-SⅡ型高壓滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備;SW-CJ-1FD型潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限;DHP9082型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶粕多糖的提取 通過預(yù)試驗得到最佳提取條件:稱取1 kg的脫脂山茶籽粕,于100 ℃水浴中提取3 h,所得殘渣提取2 h,合并多糖提取液。提取液經(jīng)過濾離心后,用80%乙醇醇沉過夜,將所得沉淀溶于蒸餾水中,用Sevag試劑(正丁醇∶氯仿=1∶4)脫除其中的蛋白質(zhì)。重復(fù)5次后,低壓蒸發(fā)除去殘留溶劑,用大孔樹脂脫色兩次,濃縮溶液。將濃縮液用80%乙醇醇沉,所得沉淀經(jīng)冷凍干燥(-70 ℃，0.133 Pa,3 d)獲得茶粕多糖粗品(TSCP)。

1.2.2 茶粕多糖的初步純化 通過預(yù)試驗得到最佳純化條件:稱取一定量茶粕多糖粗品,溶于蒸餾水中配制成10 mg/mL,8000 r/min離心15 min,取上清液,經(jīng)0.45 μm膜過濾,在DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱上進行上樣,通過自動部分收集器收集洗脫液。洗脫參數(shù)為:上樣量5 mL,每管收集時間3 min,10 mL/管,洗脫液體積為2倍柱體積,收集100管。洗脫液為蒸餾水和不同濃度的NaCl溶液。采用苯酚硫酸法[5]跟蹤檢測每兩管洗脫液A490 nm,以溶液吸光值和NaCl濃度為縱坐標(biāo),試管數(shù)為橫坐標(biāo),繪制洗脫曲線。收集洗脫液中的主要成分,50 ℃濃縮至約30 mL,然后真空冷凍干燥(-70 ℃，0.133 Pa,3 d)后獲得初步純化的多糖組分。

1.2.3 脫鹽

1.2.3.1 透析袋脫鹽 取500 Da的透析袋,加入100 mL 10 mg/mL多糖溶液,置于蒸餾水中并不斷攪拌。每次攪拌2 h,重復(fù)若干次,直至加入2% AgNO3后無明顯渾濁。合并幾次透析后的溶液并適當(dāng)濃縮,以便進行下一步的凝膠柱脫鹽。

1.2.3.2 G-25凝膠柱脫鹽 取5 mL初步脫鹽的多糖溶液,進行Sephadex-G25葡聚糖凝膠柱上樣。用蒸餾水洗脫并收集,每管收集3 min,體積10 mL。用2% AgNO3溶液進行判斷溶液中是否含鹽,并分別收集洗脫液中的含糖無鹽部分和含糖有鹽部分,并將后者濃縮后重新上樣。合并所得含糖無鹽部分,50 ℃濃縮至約30 mL,然后真空冷凍干燥,獲得最終試驗樣品。

1.2.4 組成成分測定 總糖含量測定:參照王聯(lián)珠等[6]的方法;還原糖含量測定:參照趙凱等[7]的方法;糖醛酸含量測定:參照李波等[8]的方法;蛋白質(zhì)含量測定:參照黃婉玉等[9]的方法;硫酸根含量測定:參照Dodgson等[10]的方法。

1.2.5 單糖組成分析 多糖水解[11]:取5 mg多糖樣品于梨形瓶中,加入2 mol/L三氟乙酸(TFA)5 mL,置于120 ℃烘箱中水解2 h,冷卻,40 ℃下減壓旋干,加入5 mL甲醇溶液,重復(fù)4～5次以充分除去殘留的TFA。所得樣品按下述單糖標(biāo)準(zhǔn)品還原、乙?；椒ㄟM行后續(xù)處理。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品還原、乙?；?準(zhǔn)確稱取3～5 mg的D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖和L-巖藻糖,溶于5 mL蒸餾水中,加入20～30 mg硼氫化鈉(NaBH4),于室溫下間歇振蕩3 h。反應(yīng)結(jié)束后,加入冰醋酸中和過量的NaBH4,直至無起泡產(chǎn)生。加入甲醇5 mL,減壓濃縮,重復(fù)4～5次。次日,將反應(yīng)產(chǎn)物置于110 ℃烘箱中干燥20 min,除去殘留溶劑。加入4 mL醋酐,于100 ℃烘箱中反應(yīng)2 h,冷卻后加入3～5 mL甲醇減壓濃縮,并重復(fù)4～5次。加入10 mL氯仿溶解乙酰化產(chǎn)物,并加入少量蒸餾水振蕩。靜置5 min,吸去上層水溶液,再加入蒸餾水重復(fù)多次,直至氯仿層溶液變得澄清透明。加入過量無水硫酸鈉,振蕩,溶液過0.45 μm有機膜,GC-MS上樣分析。

GC-MS分析條件:柱溫60 ℃,初始溫度120 ℃,保持1 min,以5 ℃/min升溫至240 ℃,保持10 min。傳輸線溫度250 ℃,離子源EI溫度280 ℃,分流比30∶1。質(zhì)譜掃描范圍40～500 amu,間隔時間0.2 s。以高純氮氣作載氣,溶劑延遲3 min。

1.2.6 紅外分析 參照徐金楠等[12]的方法。取3 mg左右的多糖樣品,采用KBr壓制成片后進行紅外光譜分析,光譜掃描范圍為4000～400 cm-1。

1.2.7 抗氧化性評價

1.2.7.1 DPPH自由基清除率測定 參照Wu等[13]的方法,取2.5 mL多糖溶液和0.5 mL 430 μmol/L DPPH無水乙醇溶液混合均勻,2500 r/min下離心5 min,在25 ℃下于暗處避光反應(yīng),60 min(含離心時間)后,于517 nm處測定其吸光值。

DPPH自由基清除率=(Asample-Acontrol)/(Ab-Acontrol)

式中：Asample:加入樣品反應(yīng)液吸光值,Acontrol:不含樣品反應(yīng)液吸光值,Ab:含樣品但不含DPPH自由基反應(yīng)液吸光值。

1.2.7.2 ABTS自由基清除率測定 參照Luo等[14]的方法,取等體積的7 mmol/L ABTS自由基和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液,25 ℃條件下避光反應(yīng)16 h,用磷酸緩沖溶液(pH=7.4)將其稀釋至OD=0.70±0.02(734 nm),作為ABTS+·工作液。

取0.4 mL樣品溶液和3 mL ABTS+·工作液混合均勻,在25 ℃下,避光反應(yīng)10 min后,于732 nm處測定其吸光值。

ABTS自由基清除率=(Asample-Acontrol)/(Ab-Acontrol)

式中：Asample:加入樣品反應(yīng)液吸光值,Acontrol:不含樣品反應(yīng)液吸光值,Ab:含樣品但不含ABTS自由基反應(yīng)液吸光值。

1.2.7.3 ·OH自由基清除率測定 參照Jin等[15]的方法,將19 mL 0.2 mol/L NaH2PO4與81 mL 0.2 mol/L Na2HPO4混合均勻,配制0.2 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)。向20 mL試管中依次加入0.6 mL 5 mmol/L鄰二氮菲、0.4 mL 0.2 mol/L PBS、0.6 mL 5 mmol/L FeSO4和1.5 mL樣品溶液,混合均勻后,加入0.5 mL 0.1% H2O2振蕩,隨即置于37 ℃水浴中60 min,于536 nm處測定,吸光值為Asample。

·OH自由基清除率=(Asample-Acontrol)/(Ab-Acontrol)

式中：Asample:加入樣品反應(yīng)液吸光值,Acontrol:不含樣品反應(yīng)液吸光值,Ab:含樣品但不含·OH自由基反應(yīng)液吸光值。

1.2.8 抑菌活性研究 培養(yǎng)基選用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

菌種活化:將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌3種菌種接種至斜面培養(yǎng)基,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化24 h。

抑菌試驗:將菌種稀釋于無菌水中制備成菌懸液,再將滅菌后的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)基,凝固后取1 mL菌懸液倒入培養(yǎng)皿中,并用涂布棒涂抹均勻。用鑷子將浸泡過無菌水和茶粕多糖溶液(10 mg/mL)的濾紙片(直徑6 mm),輕放在培養(yǎng)基表面,左右各一片。將培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng),24 h后觀察抑菌效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5工具進行圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的洗脫曲線

在DEAE-Sepharose離子柱上用不同濃度的NaCl溶液洗脫茶粕多糖,洗脫結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出,洗脫曲線上有三個明顯的洗脫峰,分別是用蒸餾水、0.1 mol/L NaCl和0.5 mol/L NaCl溶液洗脫所得。其中,用蒸餾水和0.1 mol/L NaCl洗脫液得到的多糖含量較高,而0.5 mol/L NaCl洗脫得到的多糖含量較低,因此收集前兩種洗脫液洗脫得到的多糖組分,經(jīng)過脫鹽和冷凍干燥之后,得到TSCP-1和TSCP-2兩種多糖組分。

圖1 TSCP DEAE-Sepharose洗脫曲線Fig.1 The elution curve of DEAE-Sepharose column for TSCP

2.2 組成分析

從表1中可以看出,TSCP、TSCP-1和TSCP-2的總糖含量分別為72.25%、84.75%和88.75%。經(jīng)離子柱分離純化后,TSCP-1和TSCP-2中的蛋白質(zhì)含量分別為0.013和0.25%,而未經(jīng)過柱子的TSCP中蛋白質(zhì)含量為4.06%,說明DEAE-Sepharose離子柱可以有效地除去茶粕多糖中的蛋白質(zhì)組分。此外,在純化過程中糖醛酸的含量也降低了50%左右。而且三種多糖組分中均含有一定量的硫酸根,這表明三種多糖均為硫酸多糖。在王黎明[16]的研究中也發(fā)現(xiàn)茶多糖結(jié)構(gòu)中含有硫酸根。

通過GC-MS分析三種多糖組分,對照標(biāo)準(zhǔn)品圖譜(圖2),確定了三種單糖成分的組成,結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出,茶粕多糖主要由葡萄糖(92.59%)組成,其次為阿拉伯糖(4.47%)和半乳糖(2.94%),還含有微量鼠李糖和甘露糖(表中未列出),而巖藻糖則未檢出。經(jīng)過離子柱后的兩種多糖組分,幾乎全部由葡萄糖組成,含量均超過99%,而阿拉伯糖和半乳糖的含量則明顯下降,分別減少至0.20%和0.40%。

表1 三種多糖組分的化學(xué)組成Table 1 Chemical composition of three polysaccharide components

圖2 六種不同單糖標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS圖譜Fig.2 The GC-MS chromatograms of 6 standard monosaccharides

2.3 紅外分析

圖3為三種多糖組分的紅外光譜圖,從圖3中可以看出3個多糖組分具有相似的吸收峰。其中,3395 cm-1處的強寬峰為羥基基團[17],在2929 cm-1的吸收峰較弱,為C-H伸縮振動峰,1418 cm-1處的吸收峰更是進一步證實了C-H伸縮振動的存在[18]。1650 cm-1處出現(xiàn)一個明顯的峰,為羥基的變形振動峰,而1369 cm-1的峰可能對應(yīng)著CH3的對稱變形振動。三種多糖組分差異性在于,TSCP在1240 cm-1處出現(xiàn)一個明顯的峰,而另外兩種多糖組分則在850 cm-1處出現(xiàn)一個吸收峰,兩個吸收峰分別對應(yīng)著硫酸酯中S-O基團的伸縮振動和軸向位置硫酸酯中C-O-S的彎曲振動(也可能為α-糖苷鍵的振動),這也證實了茶粕多糖為硫酸根多糖。此外,多個吸收峰在1000～1200 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn),表明C-O-C和C-O-H鍵的存在[19];其中,1080 cm-1左右處的吸收峰為呋喃糖苷的特征吸收峰[20]。

圖3 三種多糖組分的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of the three polysaccharide components

2.4 抗氧化性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH·是一種穩(wěn)定的有機自由基,能夠接受抗氧化劑提供的電子或質(zhì)子形成穩(wěn)定的化合物[21]。三種多糖組分對DPPH自由基清除能力如圖4所示。從圖4中可以看出,DPPH·的清除率隨著多糖濃度的增加而增加。三種多糖組分在濃度低于0.5 mg/mL時,對DPPH·的清除效果較差,不到10%。當(dāng)濃度超過1.0 mg/mL時,TSCP對DPPH·的清除率迅速上升,并在最大濃度10.0 mg/mL時達到59.15%。而TSCP-1和TSCP-2對DPPH·的清除能力則較弱,清除率均只有20%左右,遠遠低于TSCP的清除能力。茶粕多糖經(jīng)離子柱純化后,對DPPH·的清除能力明顯下降,主要原因是TSCP中糖醛酸和蛋白質(zhì)含量較高,而糖醛酸含有豐富的羧基和羥基,能夠給DPPH·提供質(zhì)子，從而清除DPPH自由基[22]。Wang等[23]的研究表明DPPH·清除能力與糖醛酸和蛋白質(zhì)的含量有著密切聯(lián)系。

圖4 三種多糖組分對DPPH·自由基的清除能力Fig.4 Scavenging ability of DPPH free radicals by three polysaccharide components

2.4.2 ABTS自由基清除能力 三種多糖組分對ABTS+·的清除能力如圖5所示,其結(jié)果與DPPH·清除能力類似,TSCP具有最佳的ABTS+·清除效果。在0～10 mg/mL范圍內(nèi),ABTS+·清除率隨多糖含量的增加而增加,并在10 mg/mL濃度時達到45.23%,明顯要低于DPPH·清除率。而在多糖濃度高于2.0 mg/mL,TSCP-2的清除效率要高于TSCP-1。因此,三者對ABTS+·的清除能力為TSCP>TSCP-2>TSCP-1。這與三者中蛋白質(zhì)含量一致,表明蛋白質(zhì)含量與ABTS+·的清除率有著密切的聯(lián)系。

圖5 三種多糖組分對ABTS自由基的清除能力Fig.5 Scavenging test of ABTS free radicals by three polysaccharide components

2.4.3 ·OH自由基清除能力 三種多糖組分對·OH清除能力見圖6,從圖6中可以看出,在0.5～10 mol/L范圍內(nèi),TSCP和TSCP-1對·OH的清除率隨著多糖濃度的增加而迅速增強,并同時在10 mg/mL時,對·OH的清除率達到50%。隨著TSCP-2濃度的提升,對·OH的清除率趨于平緩,而且TSCP-2對·OH的清除率較前兩者明顯降低,只有10%左右。TSCP和TSCP-1對于·OH的清除率要遠高于TSCP-2,這可能是由于TSCP-2中硫酸根含量較少,只有3.67%,而TSCP和TSCP-1中硫酸根含量分別為4.67%和5.63%。有研究[24]表明,硫酸根多糖在體外具有很強的·OH清除能力,是因為硫酸根能與金屬離子發(fā)生螯合反應(yīng),從而抑制了·OH的生成。

圖6 三種多糖組分對·OH自由基的清除能力Fig.6 Scavenging test of ·OH free radicals by three polysaccharide components

綜上可知,三種多糖組分對不同自由基表現(xiàn)出差異性的清除效果,可以初步判斷,其抗氧化能力依次為TSCP、TSCP-1和TSCP-2。茶粕多糖對DPPH·和ABTS+·的清除效果與糖醛酸和蛋白質(zhì)含量密切相關(guān),而·OH清除效果則與多糖中硫酸根含量密切相關(guān)。除此之外,其化學(xué)組成[25]、分子量、結(jié)構(gòu)及存在的抗氧化物質(zhì)也是抗氧化性能主要的影響因素[26]。

2.5 抑菌活性分析

本文對多糖抑菌活性進行了探究,結(jié)果如表2所示。從表中可以看出,TSCP對大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的抑菌效果最差,TSCP-1和TSCP-2對3種菌種的抑制效果則較為明顯。其中,TSCP對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出比較微弱的抑制作用,而對金黃色葡萄球菌沒有抑制作用。而TSCP-1和TSCP-2對3種菌種的抑制效果相似,都對E.coli和S.aureus具有較好的抑制效果,而對B.subtilis的抑制效果一般,而且TSCP-2和TSCP-1都比TSCP抑菌效果好。這表明經(jīng)過純化的多糖組分具有更好的抑菌效果,這與王晶晶等[27]的研究結(jié)論類似:經(jīng)純化后的多糖組分相比粗多糖具有更好的抑菌活性。然而,目前對茶粕多糖抑菌機理的研究報道較少,這將是今后潛在的研究方向。

表2 三種多糖組分的抑菌效果Table 2 Antibacterial activities of 3 different TSCP fractions

3 結(jié)論

熱水浸提茶粕多糖TSCP經(jīng)DEAE-Sepharose離子柱分離純化后,得到兩種主要的多糖組分TSCP-1和TSCP-2。結(jié)果表明此多糖為硫酸根多糖,且主要單糖組成為葡萄糖。純化后的組分TSCP-1和TSCP-2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較好的抑制效果,而對枯草芽孢桿菌效果較差。茶粕多糖粗品對DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和·OH自由基清除率均優(yōu)于純化組分,且清除率隨多糖濃度升高而增大,并于10 mg/mL達到最大清除率,分別為59.15%、45.23%和50%。這表明茶粕多糖具有良好的自由基清除效果,并且具有一定的抑菌效果。這為進一步探討茶粕多糖功能活性奠定了基礎(chǔ),同時也為茶粕多糖的精深加工及高值化利用提供了一定的理論依據(jù)。