荸薺加工廢棄物混合發(fā)酵法 制備水產(chǎn)益生菌的工藝優(yōu)化

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(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室,廣東廣州 510300; 2.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東廣州 510507; 3.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院,廣東廣州 510000; 4.廣州市洲星食品有限公司,廣東廣州 510000)

荸薺(Eleocharisdulcis)俗稱馬蹄,在中國種植面積約63萬畝,年產(chǎn)量60～85萬噸,其中以廣東、廣西地區(qū)種植較為集中。荸薺加工食品有荸薺粉、荸薺糕、荸薺露等。2016年荸薺工業(yè)加工食品產(chǎn)值已達(dá)872億元,每年荸薺加工所產(chǎn)生的廢渣、廢水約300萬噸,給生態(tài)環(huán)境帶來了極大的壓力[1-3]。但是,研究發(fā)現(xiàn)荸薺加工廢棄物含有一定的淀粉、蛋白、糖、脂肪、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)和抗菌活性物質(zhì)[4-6],是一種較為理想的水產(chǎn)飼料來源。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,抗生素和藥物的人為濫用對環(huán)境安全與人類健康的消極影響已日益突顯,水產(chǎn)養(yǎng)殖中有益微生物逐步替代抗生素和激素已成為趨勢,這也將為人們提供更安全的綠色食品[7]?；谏鲜鲈?本實驗選擇在動物體內(nèi)具抑制胃腸道中致病菌繁殖、增強機體免疫能力的植物乳桿菌和能夠幫助機體消化食物、合成較齊全氨基酸從而提高飼料生物效價的釀酒酵母作為發(fā)酵菌種[8-10]。以荸薺加工過程產(chǎn)生的大量廢渣廢水等廢棄物為原料制備養(yǎng)殖用益生菌添加劑,解決荸薺加工過程產(chǎn)生廢棄物對環(huán)境的污染,也為水產(chǎn)養(yǎng)殖提供水產(chǎn)益生菌減少養(yǎng)殖過程抗生素的使用產(chǎn)生重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)凍干粉 活菌量為400×109CFU/g,標(biāo)記為BL191,為本實驗室分離-40 ℃保存;釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)凍干粉 活菌量為700×109CFU/g,標(biāo)記為SC187,購自廣州微生物研究所;荸薺粉生產(chǎn)工業(yè)廢渣(由荸薺經(jīng)水清洗、打碎,提取荸薺粉后所留下的荸薺渣)、荸薺粉生產(chǎn)工業(yè)廢水(提取荸薺粉后所留下的槽沉廢水) 均為廣州洲星食品有限公司;氨基酸標(biāo)品 北京普合生物技術(shù)有限公司。

Centrifuge 5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;PL303分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MP511 Lab pH Meter 上海三信儀表廠;MOF-4086S低溫冰箱 日本三洋公司;HH-6數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司;A300氨基酸自動分析儀 德國曼默博爾;Agilent 1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 荸薺加工廢棄物適宜微生物的篩選 取植物乳桿菌(BL191)、釀酒酵母(SC187)、植物乳桿菌(BL191)與釀酒酵母(SC187)的混合菌種分別加入滅菌0.75% NaCl溶液,混合均勻,制得1×108CFU/mL的菌種液。將菌種液按1∶10 (v/v)的比例分別接種到下列試驗編號的樣品中。1號瓶:800 mL荸薺廢水,置1 L滅菌廣口瓶中;2號瓶:400 g荸薺廢渣,加400 mL無菌水,置1 L滅菌廣口瓶中。接種后于(37±0.5) ℃發(fā)酵48 h,進行感官分析(1.2.2)和乳酸菌數(shù)和酵母計數(shù),選擇發(fā)酵微生物。

1.2.2 感官評價 由男、女各5名實驗員,進行感官評價技術(shù)培訓(xùn)后按以下步驟進行感官評價。取出適量樣品(約10～15 g),置于光線充足、無異味的白色濾紙上或玻璃器皿內(nèi),進行目測,觀察其色澤、形態(tài),用口嘗其滋味、鼻聞其氣味[11]。

1.2.3 乳酸菌數(shù)和酵母菌數(shù)測定方法 乳酸菌數(shù)和酵母菌數(shù)分別按GB4789.35-2016操作檢測[12],GB4789.15-2016操作檢測[13]。

1.2.4 單因素實驗 由于荸薺加工過程,產(chǎn)生的廢水量是廢渣的2倍以上[14],所以考慮到合理利用荸薺加工廢棄物,本文所有實驗均以荸薺的廢渣和廢水1∶2 (V/V)混合物為發(fā)酵基料,以發(fā)酵后的活乳酸菌數(shù)和酵母菌數(shù)為指標(biāo),考察不同發(fā)酵條件對發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響。

1.2.4.1 接種比例對發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響 將BL191與SC187按1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1質(zhì)量比混合后按8% (v/v)接種于廢渣和廢水混合物中[15],(37±0.5) ℃發(fā)酵48 h,每組實驗重復(fù)3次,確定合適的混合菌種混合比例。

1.2.4.2 接種量對發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響 將BL191∶SC187按3∶7比例混合,分別以不同的接種量(6%、8%、10%、12%、14%)接種于廢渣和廢水混合物中,(37±0.5) ℃發(fā)酵48 h后測試結(jié)果,每組實驗重復(fù)3次,確定合適的混合菌種接種量。

1.2.4.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響 將BL191∶SC187按3∶7(1.2.4.2得出，g/g)混合,以混合菌種12%(v/v)接種量于廢渣和廢水混合物中,于不同的發(fā)酵溫度下(26、30、34、37、42 ℃)分別發(fā)酵48 h后測試結(jié)果,每組實驗重復(fù)3次,確定合適的混合菌種生長的溫度。

1.2.4.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵液中活菌數(shù)的影響 將BL191∶SC187按3∶7 (g/g)混合,以混合菌種12%(v/v)接種量于廢渣和廢水混合物中,37 ℃發(fā)酵。在不同發(fā)酵時間(24、36、48、60、72 h)后測試結(jié)果,每組實驗重復(fù)3次,確定適合的發(fā)酵時間。

1.2.5 正交試驗優(yōu)化復(fù)合菌種發(fā)酵條件 以發(fā)酵后的活乳酸菌數(shù)和酵母菌數(shù)為指標(biāo)進行4因素3水平的L9(34)正交試驗,各因素及水平設(shè)計如表1所示,每組實驗重復(fù)3次。

表1 荸薺加工廢棄物微生物發(fā)酵正交實驗因素水平Table 1 Factors of water chestnut processing waste microbial fermentation orthogonal experiment

1.2.6 荸薺加工廢棄物營養(yǎng)成分分析 對荸薺加工廢渣廢水1∶2 (V/V)混合物發(fā)酵前后分別進行總糖、蛋白質(zhì)、總酸(以乳酸計)、乳酸、脂肪、淀粉、粗纖維、膳食纖維等營養(yǎng)成分含量比較,測定方法如下:總糖:按GB 5009.8-2016方法檢測[16];蛋白質(zhì):按GB 5009.5-2016方法檢測[17];總酸(以乳酸計):按GB/T 12456-2008方法檢測[18];乳酸:按SN/T 2007-2007方法檢測[19];脂肪:按GB 5009.6-2016方法檢測[20];淀粉:按GB 5009.9-2016方法檢測[21];粗纖維:按GB/T 5009.10-2003方法檢測[22];膳食纖維:按GB 5009.88-2014方法檢測[23];氨基酸:按GB 5009.124-2016方法檢測[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0 軟件,采用單因素方差分析進行顯著性差異比較(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵適宜微生物的篩選

如表2所示,單一菌種接種表明BL191和SC187均可以分別利用荸薺淀粉廢水和荸薺渣中有機營養(yǎng)物質(zhì)進行生長發(fā)酵并成為優(yōu)勢菌群。在荸薺渣中BL191和SC187分別可達(dá)到菌數(shù)最高14.1×108和9.0×108CFU/g。兩種菌混合接種表明BL191和SC187可以在共生條件中利用荸薺淀粉廢水和荸薺渣中有機營養(yǎng)物質(zhì)進行生長發(fā)酵并成為優(yōu)勢混合菌群。在荸薺渣中BL191和SC187混合發(fā)酵分別可達(dá)可達(dá)到菌數(shù)最高13.5×108和8.1×108CFU/g。因此,以荸薺加工過程產(chǎn)生的大量廢渣廢水為原料利用兩種益生菌BL191和SC187混合發(fā)酵法制備水產(chǎn)養(yǎng)殖，用益生菌添加劑是可行的。

表2 BL191和SC187在荸薺加工廢棄物中的發(fā)酵菌落數(shù)Table 2 Microbial content of BL191 and SC187 in processing wastes of water chestnut

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 菌種最適混合比例 如表3,當(dāng)植物乳桿菌、釀酒酵母混合比例為1∶9時酵母菌達(dá)到峰值17.1×108CFU/g,此時乳酸菌只有8.9×108CFU/g,可能是由于酵母菌過快生長產(chǎn)生的酒精抑制了乳酸菌生長;當(dāng)植物乳桿菌、釀酒酵母比例為9∶1時乳酸菌數(shù)最高,達(dá)到39.1×108CFU/g,此時酵母菌只有3.1×108CFU/g,可能是由于乳酸菌過快生長產(chǎn)生的乳酸抑制了酵母菌生長。當(dāng)植物乳桿菌、釀酒酵母比例為3∶7時,此時乳酸菌為28.2×108CFU/g,酵母菌為16.1×108CFU/g,混合菌活菌總數(shù)為44.3×108CFU/g,達(dá)到最高。因此選擇植物乳桿菌、釀酒酵母比例為3∶7。

表3 兩種菌不同接種比例的菌落數(shù)Table 3 Microbial content of inoculation ratio of two strains

2.2.2 最適接種量 如表4隨著接種量的增大,發(fā)酵后植物乳桿菌、釀酒酵母活菌數(shù)都出現(xiàn)了上升趨勢,直到接種量為12%時出現(xiàn)了拐點,此時乳酸菌活菌數(shù)最高,達(dá)到29.1×108CFU/g,酵母菌為16.3×108CFU/g,混合菌活菌總數(shù)為45.4×108CFU/g。當(dāng)接種量為14%時植物乳桿菌、釀酒酵母活菌數(shù)并沒有隨著接種量的增多而上升,當(dāng)發(fā)酵菌成為優(yōu)勢菌群后受接種量的影響變小。因此,選擇混合菌種的接種量為12%。

表4 兩種菌不同接種量的菌落數(shù)Table 4 Microbial content of inoculum size of two strains

2.2.3 最適發(fā)酵溫度 兩種益生菌具有各自適宜的生長溫度條件[9,25],通過發(fā)酵溫度選擇單因素實驗可以了解到在不同溫度條件下它們的共同生長情況。結(jié)果如表5,乳酸菌在37 ℃為適宜生長溫度,出現(xiàn)峰值為29.9×108CFU/g;酵母菌在34 ℃為適宜生長溫度,出現(xiàn)峰值為18.9×108CFU/g。37 ℃時混合菌活菌總數(shù)出現(xiàn)峰值46.2×108CFU/g,因此37 ℃為適宜混合菌種生長溫度。

表5 不同發(fā)酵溫度的菌落數(shù)Table 5 Microbial content of different fermentation temperatures

2.2.4 最適發(fā)酵時間 兩種益生菌具有各自增長速率[9,26],結(jié)果如表6。24 h內(nèi)酵母菌快速增長,24 h后酵母活菌數(shù)基本保持穩(wěn)定。而乳酸菌則是在發(fā)酵后24～48 h出現(xiàn)快速增長,48 h后乳酸菌總數(shù)開始下降。選擇發(fā)酵48 h最佳,混合菌活菌總數(shù)出現(xiàn)峰值47.2×108CFU/g。

表6 不同發(fā)酵時間的菌落數(shù)Table 6 Microbial content of different fermentation times

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上用正交實驗優(yōu)化工藝參數(shù)。表7表明,影響植物乳桿菌(BL191)發(fā)酵的主要因素依次為接種比例B、接種量A、溫度D、時間C,最佳發(fā)酵條件是A3B2C2D3,即接種量12%、BL191與SC187比例為3∶7 (g/g)、發(fā)酵時間48 h和發(fā)酵溫度37 ℃;影響釀酒酵母(SC187)發(fā)酵的主次因素依次為溫度D、接種量A、接種比例B、時間C,最佳發(fā)酵條件是A3B2C2D2,即接種量12%、BL191與SC187比例為3∶7 (g/g)和發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度34 ℃。

表7 正交實驗優(yōu)化培養(yǎng)條件結(jié)果Table 7 Experimental results of orthogonal experiment

如表8驗證實驗結(jié)果可知,在植物乳桿菌(BL191)最佳工藝條件A3B2C2D3,植物乳桿菌(BL191)菌數(shù)為39.9×108CFU/g,釀酒酵母(SC187)菌數(shù)為7.9×108CFU/g;在釀酒酵母(SC187)最佳條件A3B2C2D2,植物乳桿菌(BL191)菌數(shù)為33.9×108CFU/g,釀酒酵母(SC187)菌數(shù)為15.9×108CFU/g;正交實驗中混合菌活菌總數(shù)最高組合為A3B2C1D3,植物乳桿菌(BL191)菌數(shù)為27.1×108CFU/g,釀酒酵母(SC187)菌數(shù)為11.2×108CFU/g。綜合考慮兩種微生物的在終產(chǎn)品微生物飼料添加劑的實際利用價值,選擇A3B2C2D2為發(fā)酵條件,此時兩種有益菌總和為49.8×108CFU/g,混合菌活菌總數(shù)RSD為0.07%。

表8 驗證實驗結(jié)果(n=3)Table 8 Results of verification experiment(n=3)

2.4 發(fā)酵前后營養(yǎng)成分分析

如表9,其中總糖、淀粉含量顯著降低,乳酸、總酸升高,說明混合菌種利用廢渣廢水混合物的總糖、淀粉成分進行有機酸的轉(zhuǎn)換,乳酸/總酸比值為97.7%,說明混合菌種在進行乳酸發(fā)酵。

表9 荸薺加工廢棄物發(fā)酵前后營養(yǎng)成分含量分析Table 9 Nutrient content analysis of water chestnut wastes before and after fermentation

采用該工藝發(fā)酵荸薺加工后的廢水和廢渣制備的微生物飼料中產(chǎn)生大量乳酸,乳酸在生物體內(nèi)可以使胃、腸中的pH降低,生物體中多為酸性消化酶[27],從而可以激發(fā)酶的活性作用[28]。

經(jīng)混合菌發(fā)酵后荸薺廢渣廢水1∶2混合物結(jié)果如表10。氨基酸總量由4.4 g/100 g上升為7.9 g/100 g。18種氨基酸均出現(xiàn)了上升,8種必需氨基酸除亮氨酸外均增加了50%以上,亮氨酸增加48.3%。釀酒酵母(SC187)可以產(chǎn)生較齊全氨基酸,提高了水產(chǎn)微生物飼料的營養(yǎng)價值。

表10 荸薺廢渣廢水1∶2混合物發(fā)酵前后氨基酸成分含量分析Table 10 Amino acid content analysis of water chestnut waste mixture before and after fermentation

3 結(jié)論

采用BL191和SC187兩種益生菌復(fù)合發(fā)酵荸薺加工廢棄物,能制備出富含益生菌和氨基酸的發(fā)酵液。通過單因素實驗和正交試驗優(yōu)化得到BL191和SC187復(fù)合發(fā)酵荸薺廢渣廢水制備微生物飼料的最佳工藝條件為荸薺渣、荸薺廢水混合比例1∶2 (g/mL),BL191和SC187按3∶7 (g/g)比例混合,接種量12%,發(fā)酵溫度34 ℃,發(fā)酵時間48 h,制備得到的微生物飼料中BL191菌數(shù)為33.9×108CFU/g,SC187菌數(shù)為15.9×108CFU/g;含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),其氨基酸總量較發(fā)酵前提高了1.8倍,亮氨酸增加了48.3%,其他7種必需氨基酸均提高了50%以上。

該工藝不僅為水產(chǎn)養(yǎng)殖提供一種很好的益生菌飼料添加劑,而且使荸薺加工后廢水、廢渣得到充分利用。益生菌可以提高養(yǎng)殖水產(chǎn)品的抗病性,因而可以減少抗生素的使用,針對目前養(yǎng)殖中濫用抗生素有著重要的意義。