新型耐熱耐酸普魯蘭酶的 分離純化與酶學(xué)特性分析

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(1.徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院,江蘇徐州 221018; 2.江蘇智薈生物科技有限公司,江蘇徐州 221018; 3.邳州市金大地肥料有限公司,江蘇徐州 221018)

普魯蘭酶是一種水解支鏈淀粉分支點(diǎn)中的α-1,6-糖苷鍵的酶[1],主要使支鏈淀粉型多糖的分支鏈脫離主鏈,從而加速糖化過(guò)程,有效的提高淀粉利用率和水解效率,降低能耗[2]。在食品領(lǐng)域,通常與淀粉酶結(jié)合使用,生產(chǎn)果糖和麥芽糖糖漿[3]。當(dāng)普魯蘭酶以普魯蘭糖為原料時(shí)，水解產(chǎn)物主要是麥芽三糖糖漿,其在食品工業(yè)中有重要應(yīng)用價(jià)值,與麥芽糖漿、葡萄糖漿等相比,其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在:抑制食品的冰點(diǎn)凝固、賦予柔和的甜度、增加持水性、防止淀粉重結(jié)晶、減少色素形成等[4]。因此,普魯蘭酶可以在焙烤食品、甜點(diǎn)以及醫(yī)藥注射代替葡萄糖等領(lǐng)域中應(yīng)用[5-6]。在生物能源方面,以淀粉等生物質(zhì)資源開(kāi)發(fā)乙醇、丁醇等生物燃料也是當(dāng)前能源開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[7]。

普魯蘭酶廣泛分布于絲狀真菌、細(xì)菌、酵母、植物和動(dòng)物中[6],如芽孢桿菌(Bacillussp.)AN-7[8],厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillussp.)LM18-11[9],水棲熱袍菌(Thermotoganeapolitana)[10],巴倫葛茲類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillusbarengoltzii)[11]。然而,由于酶在產(chǎn)量、穩(wěn)定性及特殊環(huán)境下的活性等局限,用于工業(yè)化生產(chǎn)的普魯蘭酶非常有限。目前,很多研究報(bào)道了不同特性的普魯蘭酶,如嗜熱棲熱菌(ThermusthermophilusHB27)[12]來(lái)源的耐熱性達(dá)到70 ℃的普魯蘭酶;來(lái)源于嗜堿芽孢桿菌(Bacilluspseudofirmus703)的耐受表面活性劑的普魯蘭酶[13]。雖然有不同特性的普魯蘭酶報(bào)道,但是特性單一,不能滿(mǎn)足對(duì)多種特性需求的工業(yè)化生產(chǎn)需要,如目前淀粉糖化過(guò)程一般在60 ℃高溫和pH4.5的弱酸性條件下進(jìn)行48～60 h[9],在此過(guò)程中普魯蘭酶不僅要維持高的催化活性還要保持高穩(wěn)定性,而根據(jù)文獻(xiàn)，符合這種多元化條件的普魯蘭酶非常有限。

本研究首次從泡盛曲霉中分離純化的普魯蘭酶，不僅具有較高的酸、熱穩(wěn)定性,并能在酸性、高溫環(huán)境下維持高活性,同時(shí)對(duì)普魯蘭糖具有專(zhuān)一的高效催化活性。該酶有望在麥芽三糖糖漿生產(chǎn)、食品飲料、生物能源、日用洗滌劑等行業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 本實(shí)驗(yàn)室從土壤樣品中分離的一株菌株XF;普魯蘭糖 Sigma公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、牛血清白蛋白、及低分子量蛋白Marker 上海生工生物工程有限公司;Sephacry S-100、DEAE-Sepharose Fast Flow、Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow Pharmacia公司;種子培養(yǎng)基(w/v) 2%糯米淀粉,2% 酵母提取物,0.5% NH4H2PO4,0.2% NaNO3,0.1% NH4NO3、0.2% KH2PO4,0.1% NaCl,0.05% MgSO4·7H2O,0.01% ZnSO4·7H2O,0.01% FeSO4·7H2O,調(diào)整pH調(diào)至5.5;發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2%的蛋白胨,其他不變。

AKTA Explorer 100型蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司產(chǎn)品;Hoefer 2-D Electrophoresis電泳系統(tǒng) 美國(guó)HOEFER公司;SIGMA3K30型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;UV-2450紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)普魯蘭酶菌株的鑒定 對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離保藏的產(chǎn)普魯蘭酶菌株XF形態(tài)鑒定,28 ℃培養(yǎng)約3～6 d,觀(guān)察并記錄菌落形態(tài)、菌絲特征、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。并進(jìn)一步進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。提取菌株XF基因組,參照文獻(xiàn)[14]PCR擴(kuò)增真菌鑒定通用ITS基因序列,選用通用引物為ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測(cè)序完成,測(cè)得序列在NCBI中的BLAST程序?qū)ふ遗c其有最大同源性的序列,最終鑒定菌株XF。

1.2.2 粗酶液的制備 在4 ℃固體PDA培養(yǎng)基保存的菌株,充分活化后,接到種子培養(yǎng)基中,培養(yǎng)好后再按照體積比10%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基。發(fā)酵條件:250 mL三角瓶裝60 mL發(fā)酵液,180 r/min,38 ℃發(fā)酵6 d。然后用6層紗布將菌體過(guò)濾,濾液10000 r/min離心10 min,上清即為粗酶液。

1.2.3 PulXF活力及蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

1.2.3.1 PulXF活力的測(cè)定 酶活測(cè)定參照文獻(xiàn)[15],略有改動(dòng)。以普魯蘭糖為底物測(cè)定PulXF活力。對(duì)每步純化的酶液用磷酸緩沖溶液(pH5.0,50 mmol/L)稀釋后取0.5 mL,加入至2 mL含0.5%(g/mL)普魯蘭糖的磷酸緩沖溶液(pH5.0,50 mmol/L)中,在60 ℃下反應(yīng)20 min,加入1 mL的DNS溶液沸水浴煮10 min,補(bǔ)充去離子水使反應(yīng)體系稀釋至15 mL。迅速冷卻后在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光值。分光光度計(jì)測(cè)定酶解體系吸光值所用的空白對(duì)照同以上體系,但在加DNS后,沸水浴前加入0.5 mL酶液。

酶的活力單位定義為:在最適條件下,每分鐘水解普魯蘭糖釋放1 μmol還原糖(以葡萄糖計(jì))所需的酶量,為1個(gè)活力單位。其中,還原糖量測(cè)定采用二硝基水楊酸(DNS)法[16]。

1.2.3.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 酶液每步的純化步驟中酶液蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用Bradford法[17],以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=3.27x+0.653,相關(guān)系數(shù)R2=0.9954,y為吸光度,x蛋白質(zhì)濃度,mg/mL。

1.2.4 PulXF的分離純化

1.2.4.1 硫酸銨分級(jí)鹽析 向發(fā)酵獲得的粗酶液中緩慢加入硫酸銨,并在磁力攪拌器上連續(xù)攪拌,使其逐級(jí)達(dá)到20%飽和度,待充分沉淀后,4 ℃條件下8000 r/min離心10 min,取上清,繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度80%,充分沉淀后再次4 ℃、8000 r/min離心10 min,收集沉淀,pH6.0、20 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解,充分透析脫鹽。

1.2.4.2 離子交換柱層析 經(jīng)硫酸銨沉淀,透析除鹽后的PulXF粗酶液采用離子交換層析進(jìn)一步純化,并選用改變洗脫液離子強(qiáng)度的方法對(duì)PulXF進(jìn)行梯度洗脫。DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換介質(zhì)的層析柱(1.6 cm×30 cm)用pH6.0、20 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液充分平衡,上樣透析脫鹽后的粗酶液,同樣緩沖液洗脫至洗脫曲線(xiàn)走平,用含NaCl的緩沖液進(jìn)行0～1 mol/L的線(xiàn)性梯度洗脫。流速0.8 mL/min,每管收集3 mL,紫外監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)280 nm。測(cè)定每管PulXF活性及蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4.3 分子篩凝膠過(guò)濾層析 將離子交換層析后所得含有活性的收集管合并,超濾管濃縮后,上樣至Sephacryl S-100分子篩柱(1.6 cm×70 cm)分離純化,20 mmol/L的檸檬酸-磷酸緩沖液洗脫,流速0.8 mL/min,每管收集2 mL。

1.2.4.4 疏水層析 將處理好的Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow樹(shù)脂裝柱,用含有0.4 mol/l的(NH4)2SO4的pH6.0,20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液充分平衡至OD280基線(xiàn)走平。分子篩純化后的樣品超濾濃縮后上樣,用pH6.0,20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸的緩沖液洗脫至流出液的OD280降到0.1以下。再用含(NH4)2SO4的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH6.0、20 mmol/L)進(jìn)行1～0 mol/L濃度的線(xiàn)性梯度洗脫,流速為0.8 mL/min,每2 mL收集洗脫液,測(cè)酶活檢測(cè)純化情況。

1.2.5 酶純度分析及活性電泳 酶純度分析及分子量測(cè)定:參照Laemmli的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法進(jìn)行[18]。采用4%濃縮膠、10%分離膠,以低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(兔磷酸化酶 B:97400 Da、牛血清白蛋白:66200 Da、兔肌動(dòng)蛋白:43000 Da、牛碳酸酐酶:31000 Da、胰蛋白酶抑制劑:20100 Da、雞蛋清溶菌酶:14400 Da)作對(duì)照。

PulXF酶譜測(cè)定:與SDS-PAGE相比,酶譜測(cè)定中SDS以及β-巰基乙醇不添加,樣品不煮沸。分離膠中添加0.1%的普魯蘭糖。電壓80 V下電泳至樣品進(jìn)入分離膠時(shí),升高電壓至120 V,電泳至溴酚藍(lán)藍(lán)色條帶移動(dòng)至分離膠的最低端,結(jié)束電泳。膠置于20 mmol/L,pH5.0的檸檬酸-磷酸緩沖溶液中,50 ℃孵育1～2 h,將膠取出,加入盧戈氏碘液浸泡3～5 min,觀(guān)察有無(wú)白色條帶。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.6.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 在pH5.0及溫度30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85及90 ℃下,測(cè)定溫度對(duì)酶活力的影響,確定最適反應(yīng)溫度,以最大酶活力計(jì)為100%。以普魯蘭糖為底物,測(cè)定PulXF酶活。將酶液分別放置在不同溫度30～90 ℃下保溫1 h,測(cè)定殘余酶活,計(jì)算相對(duì)酶活。

1.2.6.2 最適反應(yīng)pH及其pH穩(wěn)定性 在60 ℃反應(yīng)溫度下,用pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5及8.0的緩沖液,以普魯蘭糖為底物,測(cè)定PulXF酶活。在不同pH的緩沖液中加入一定量的酶液,28 ℃保溫24 h后,標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定殘余酶活,以未處理的酶液的酶活計(jì)為100%,計(jì)算相對(duì)酶活。

1.2.6.3 金屬離子以及常見(jiàn)抑制劑對(duì)PulXF的影響 在純酶溶液中分別添加濃度均為5 mmol/L的金屬鹽(FeCl3、FeCl2、CaCl2、CuCl2、ZnCl2、MgCl2、KCl、NaCl、MnCl2、CoCl2、AgNO3、HgCl2、PbCl2)和不同濃度的抑制劑(0.2% DTT、1%β-巰基乙醇、1 mol/L尿素、5% SDS、5% CTAB、5% Triton X-100、5% Tween 80、2 mmol/L PMSF、5 mmol/L EDTA、30% 乙醇)分別測(cè)定酶活力,以未添加金屬離子和抑制劑的酶液的酶活計(jì)為100%,計(jì)算相對(duì)酶活。

1.2.6.4 PulXF底物特異性及水解產(chǎn)物薄層層析 選取普魯蘭糖、可溶性淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉、動(dòng)物糖原、α-環(huán)狀糊精、β-環(huán)狀糊精作為測(cè)定酶活的底物進(jìn)行分析。底物濃度為0.5%,與酶液在50 mmol/L、pH5.0的磷酸緩沖體系中60 ℃條件下反應(yīng)20 min,酶作用釋放的還原糖量通過(guò)DNS方法測(cè)定。

薄層層析方法參照文獻(xiàn)[10],稍作改動(dòng)。以50 mmol/L的磷酸二氫鈉-氫氧化鈉緩沖溶液(pH5.0)分別配制0.5%的直鏈淀粉、普魯蘭糖、可溶性淀粉、α-環(huán)糊精和支鏈淀粉溶液,各個(gè)反應(yīng)體系中按照1 U/mL的量加入PulXF,均在60 ℃下反應(yīng)8 h,反應(yīng)后將反應(yīng)產(chǎn)物上樣到硅膠板上,以正丁醇、乙醇和水(體積比為5∶3∶2)混合溶液為展開(kāi)劑,以含10%的濃硫酸的乙醇溶液為顯色劑,最后在120 ℃烘箱烘干顯色10 min。

1.2.6.5 PulXF動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 取8支試管分別加入2 mL以pH5.0、50 mmol/L磷酸緩沖溶液溶解的普魯蘭糖,使其終濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/mL,預(yù)熱到50 ℃時(shí),各加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液?？瞻讓?duì)照以去離子水代替酶液,其他相同。反應(yīng)10 min后,沸水浴終止反應(yīng)。測(cè)定不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)速度。用Lineweaver-Burk作圖法(1/V-1/[S])作圖,得到動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)繪制雙倒數(shù)曲線(xiàn),求出酶的Km值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,方差分析組間差異,結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株XF的鑒定

菌株FX在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快速。菌落平坦厚度較薄,培養(yǎng)前期菌落褐綠色后期變?yōu)楹趾谏?無(wú)滲出物,菌落邊緣菌絲呈白色。高倍鏡下觀(guān)察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)呈球狀。菌落及孢子頭具有典型的曲霉特征[19]。對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行BLAST比對(duì),菌株XF ITS序列與Aspergillusawamori(KF154413,GenBANK)和Aspergillusawamori(LC032125.1,GenBANK)的基因序列同源性為99%以上,結(jié)合菌株的形體學(xué)特征,確定菌株XF為泡盛曲霉(Aspergillusawamori)。

2.2 PulXF的分離純化

2.2.1 離子交換柱層析 離子交換層析洗脫曲線(xiàn)如圖1所示,分離純化過(guò)程出現(xiàn)7個(gè)蛋白洗脫峰。經(jīng)過(guò)酶活檢測(cè)后,發(fā)現(xiàn)第1個(gè)、第2個(gè)、第6個(gè)和第7個(gè)蛋白質(zhì)洗脫峰沒(méi)有PulXF活性。第3個(gè)到第5個(gè)均有酶活,第4個(gè)蛋白峰含酶量較高,且酶活較高,對(duì)應(yīng)的NaCl洗脫濃度約為0.68 mol/L。

圖1 PulXF的離子交換層析Fig.1 Ion exchage chromatography of PulXF

2.2.2 分子篩凝膠柱層析 分子篩層析結(jié)果如圖2所示,從圖2中可以看出,樣品溶液分離后得到了4個(gè)獨(dú)立的洗脫峰。經(jīng)酶活檢測(cè)后,對(duì)比蛋白質(zhì)濃度曲線(xiàn)發(fā)現(xiàn),酶活集中在3號(hào)峰,1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)峰為雜蛋白峰。

圖2 PulXF的分子篩凝膠過(guò)濾層析Fig.2 Gel filtration chromatography of PulXF

2.2.3 疏水層析 疏水層析洗脫曲線(xiàn)如圖3所示,酶液經(jīng)過(guò)疏水層析后,得到兩個(gè)蛋白峰,其中第1個(gè)蛋白峰沒(méi)有酶活,為雜蛋白;第2個(gè)蛋白峰具有PulXF酶活力,對(duì)應(yīng)的管數(shù)為23～28,其中26號(hào)管酶活力最強(qiáng),對(duì)應(yīng)的硫酸銨濃度為0.45 mol/L。將收集到的洗脫峰的層析液冷凍干燥濃縮后進(jìn)行蛋白電泳,考察其分離效果。經(jīng)過(guò)疏水層析后,酶比活力達(dá)到309.28 U/mL,純化倍數(shù)8.16,回收率20.05%。各步純化情況見(jiàn)表1。

表1 泡盛曲霉(Aspergillus awamori)XF PulXF純化結(jié)果Table 1 Summary of PulXF purification from Aspergillus awamori XF

圖3 PulXF的疏水層析Fig.3 Hydrophobic chromatography of PulXF

2.2.4 蛋白電泳檢驗(yàn)純度 將收集到的不同分離階段的PulXF液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析,分析結(jié)果如圖4A所示。圖中可以看出,經(jīng)離子交換層析后,雖然雜蛋白的條帶大大減少,但仍有許多雜蛋白條帶;而經(jīng)離子交換層析后及分子篩層析后,大量的雜蛋白被去除;用以上層析以及疏水層析后,所分離純化的PulXF組分達(dá)到了電泳純,純化結(jié)果為一條單一的電泳條帶。所純化出來(lái)的PulXF的分子量約為63.7 kDa。同時(shí),活性電泳染色見(jiàn)圖4B顯示了在SDS-PAGE上相應(yīng)位置的PulXF活性帶清晰的條帶表明,該酶在該位置完全水解淀粉,因此不被盧戈氏碘液溶液著色。

圖4 蛋白質(zhì)SDS-PAGE及PulXF活性電泳Fig.4 SDS-PAGE and zymogram analysis of PulXF注:1:硫酸銨鹽析泳道,2:離子交換層析泳道, 3:分子篩凝膠過(guò)濾層析泳道,4:疏水層析。

2.3 PulXF最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

溫度是影響酶活性的重要因素。從圖5中可知,不同的溫度對(duì)PulXF活性具有明顯的影響,從黑曲霉中生產(chǎn)出的PulXF最佳溫度是在60 ℃,在溫度50～65 ℃范圍內(nèi)酶活力保留在90%以上,在溫度45～80 ℃范圍內(nèi)酶活力保留在70%以上,可以看出在相當(dāng)寬的溫度范圍內(nèi)PulXF都具有良好的活性;PulXF在溫度高于65 ℃時(shí),酶活迅速下降,充分表明,提高溫度可以加快反應(yīng)速度,但溫度升高會(huì)導(dǎo)致PulXF變性,從而降低活性。從圖5中還可以看出,在溫度90 ℃時(shí)PulXF活力沒(méi)有完全喪失,酶活在40%以上,所以PulXF具有一定的耐高溫特性。

圖5也顯示了溫度在30～90 ℃內(nèi)PulXF的熱穩(wěn)定性,結(jié)果表明,PulXF在溫度30～70 ℃范圍內(nèi),相對(duì)酶活都在90%以上，幾乎沒(méi)有什么損失，表明其在30～70 ℃內(nèi)穩(wěn)定性較好。溫度低于80 ℃，相對(duì)酶活力均在85%以上，表明PulXF在低于80 ℃時(shí)具有良好的熱穩(wěn)定性。隨著溫度的繼續(xù)上升，PulXF的相對(duì)酶活降低，表明溫度高于80 ℃時(shí)，其穩(wěn)定性降低。但是PulXF的熱穩(wěn)定性并沒(méi)有完全失去，在溫度為90 ℃時(shí)，相對(duì)酶活在60%左右，可見(jiàn)PulXF在高溫下酶活還是比較穩(wěn)定的。目前,在報(bào)道的普魯蘭酶中,本研究的PulXF屬于熱穩(wěn)定性非常高的酶。耐熱性酶的熱穩(wěn)定性是工業(yè)用途的一個(gè)重要特征,表明本實(shí)驗(yàn)得到的PulXF能夠更好在工業(yè)生產(chǎn)中利用。

圖5 溫度對(duì)PulXF活性及穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity and stability of PulXF

2.4 PulXF最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

不同pH下的酶活性變化情況如圖6所示。由6圖可知,PulXF酶活隨著pH的增大呈先升再降的趨勢(shì),且能在廣泛酸堿pH的范圍都具有活性。pH5.0時(shí)PulXF活力最大,在pH4.0～8.0之間酶活力保持在80%以上。PulXF在強(qiáng)酸下酶活較低,但是沒(méi)有完全失去活性,pH3.0時(shí)相對(duì)酶活還保留80%。所以在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境下PulXF都能在工業(yè)中發(fā)揮作用。

不同pH下處理相同時(shí)間后殘余的PulXF活力如圖6所示。由圖6可知PulXF在pH3.5～6.5的酶活均在90%以上,酶活穩(wěn)定,但當(dāng)pH降至3.5以下時(shí),穩(wěn)定性急劇下降,在高酸性條件下,酶活性較低，穩(wěn)定性差?？傮w來(lái)說(shuō)PulXF在pH3.0～8.0的酶活都在75%以上,酶活穩(wěn)定性相對(duì)良好,具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

圖6 pH對(duì)PulXF活性及穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH on the activity and stability of PulXF

2.5 金屬離子和抑制劑對(duì)PulXF活性的影響

大多數(shù)普魯蘭酶都需要金屬離子進(jìn)行激活活性和維持穩(wěn)定性[20]。各金屬離子及抑制劑對(duì)酶的作用結(jié)果分別見(jiàn)圖7和圖8。Ca2+、Zn2+和Mg2+對(duì)酶有激活作用,其中Ca2+對(duì)PulXF酶活激活作用最為顯著,相對(duì)酶活高達(dá)136.78%。Na+、Fe3+、Co2+、Fe2+和K+對(duì)酶穩(wěn)定性無(wú)明顯影響,而Cu2+、Mn2+、Ag+、Hg2+和Pb2+則表現(xiàn)出不同程度的抑制作用,其中Hg2+和Pb2+對(duì)PulXF酶活幾乎完全抑制。PulXF在二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇、尿素、PMSF和EDTA的存在下酶活力會(huì)被抑制,而在CTAB、SDS、Triton X-100、Tween 80以及乙醇的存在下酶活比較穩(wěn)定,說(shuō)明酶對(duì)表面活性劑的耐受性強(qiáng)。

圖7 金屬離子對(duì)PulXF活性的影響Fig.7 Effect of mental ions on the activity of PulXF

圖8 抑制劑對(duì)PulXF活性的影響Fig.8 Effect of inhibitors on the activity of PulXF

2.6 PulXF底物特異性及水解產(chǎn)物分析

由于酶對(duì)不同底物的結(jié)合能力不同,表現(xiàn)出不同的酶活,PulXF對(duì)不同底物的水解活性見(jiàn)圖9。研究發(fā)現(xiàn),PulXF對(duì)普魯蘭糖的催化能力最高,對(duì)可溶淀性粉和支鏈淀粉的催化能力分別為普魯蘭糖的38%、26%。PulXF對(duì)結(jié)構(gòu)中只含有α-1,4-糖苷鍵的直鏈淀粉有微弱的水解作用,相對(duì)酶活僅有10.3%。對(duì)動(dòng)物糖原、α-環(huán)狀糊精、β-環(huán)狀糊精基本檢測(cè)不到酶活力。

圖9 PulXF底物特異性分析Fig.9 Substrate specificity of the purified PulXF

PulXF對(duì)不同底物的水解產(chǎn)物情況性如圖10所示,TLC分析表明,普魯蘭糖經(jīng)純化的PulXF 8 h水解后,可以徹底被完全水解,水解產(chǎn)物幾乎全部是麥芽三糖,表明,純化的PulXF對(duì)α-1,6-糖苷鍵有高效水解作用;酶對(duì)底物可溶性淀粉與支鏈淀粉也都有一定的水解作用,但水解作用同普魯蘭糖相比,非常弱,僅有非常少量的水解純化的PulXF對(duì)α-1,6糖苷鍵有專(zhuān)一性的高產(chǎn)物葡萄糖、麥芽二糖及麥芽三糖,主要因?yàn)橐陨系孜镏幸泊嬖谏倭喀?1,6糖苷鍵鏈接的支鏈結(jié)構(gòu)。對(duì)直鏈淀粉和α-環(huán)狀糊精,沒(méi)有水解作用。TLC的層析結(jié)果基本同圖9中PulXF對(duì)各底物的水解相對(duì)活性相一致。從酶對(duì)底物的降解特異性看出,PulXF幾乎只對(duì)α-1,6糖苷鍵有水解作用,對(duì)照?qǐng)?bào)道的普魯蘭酶的分類(lèi)特性[12],PulXF為I型普魯蘭酶。

圖10 PulXF對(duì)不同底物水解產(chǎn)物薄層層析分析Fig.10 TLC analysis of hydrolysis products from PulXF with various substrates注:M:G1葡萄糖 G2 麥芽糖,G3 麥芽三糖,G4麥芽四糖; 1:直連淀粉;2:α-環(huán)狀糊精;3:普魯蘭糖 同PulXF孵育8 h后產(chǎn)物;4:可溶性淀粉同PulXF孵育 8 h后產(chǎn)物;5:支鏈淀粉同PulXF孵育8 h后產(chǎn)物。

2.7 PulXF反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)分析

圖11 酶催化不同濃度的普魯蘭糖的Lineweaver-Burk曲線(xiàn)Fig.11 Lineweaver-Burk plot of enzyme activity of the purified a-amylase over varied concentration of pullulan

3 討論

隨著普魯蘭酶在實(shí)際生產(chǎn)生活中的應(yīng)用越來(lái)越廣,各種有關(guān)普魯蘭酶的研究報(bào)道增多。報(bào)道出不同來(lái)源的普魯蘭酶以及其酶學(xué)性質(zhì),雖然來(lái)源很多,但可用于工業(yè)化生產(chǎn)的非常有限[21]。目前淀粉加工工業(yè)上常需要具有熱穩(wěn)定性的普魯蘭酶,它能夠高效的水解普魯蘭糖[22]。本研究的普魯蘭酶最適溫度在60 ℃,且在80 ℃下1 h普魯蘭酶活力還保持85%以上,很適合作為工業(yè)生產(chǎn)用酶。嗜熱型I型普魯蘭酶是淀粉水解工藝在淀粉加工工業(yè)中的理想用酶,雖然已經(jīng)報(bào)道大量分離的熱穩(wěn)定性普魯蘭酶,但是由于酶產(chǎn)量低,以及pH耐受性差,所以它們的應(yīng)用受到限制[10]。本研究的PulXF最佳的作用pH4.5,在pH4.0～5.5之間都保持高的水解活性,pH3.5～5.5之間有非常強(qiáng)的穩(wěn)定性。而文獻(xiàn)報(bào)道的大多數(shù)微生物來(lái)源的普魯蘭酶最適作用pH在5.0～9.0之間[12,23-24],pH穩(wěn)定在在5.5～8.0范圍內(nèi)[8,25-26],而淀粉的糖化通常是在微酸性(pH4.0～5.5)條件下進(jìn)行,鑒于這個(gè)原因,PulXF有潛力開(kāi)發(fā)為商用普魯蘭酶,用于淀粉的糖化中。

金屬離子Ca2+對(duì)酶活性有強(qiáng)烈的激活作用,這與文獻(xiàn)報(bào)道的Bacilluscereus等來(lái)源的普魯蘭酶相一致[20]。另外,Mg2+和Zn2+也顯著促進(jìn)酶的活性。在酶的反應(yīng)體系中加入EDTA明顯抑制酶的活性,由此可以推斷,Ca2+、Mg2+和Zn2+等二價(jià)金屬離子在酶的催化活性中心對(duì)維持結(jié)構(gòu)具有重要作用。表面活性劑(SDS、CTAB、Triton X-100、Tween 80)幾乎對(duì)酶沒(méi)有抑制作用,同報(bào)道的其他來(lái)源普魯蘭酶相比,PulXF對(duì)表面活性劑有強(qiáng)的耐受性,有希望添加到日用洗滌劑中,提高洗滌效果。有機(jī)溶劑通常會(huì)對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用,而本研究的乙醇對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)顯示,酶活僅有不到10%的損失,因此在生物能源方面,PulXF可以同其他糖化水解酶共同作用,用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為工業(yè)乙醇中。

4 結(jié)論

本研究首次報(bào)道了來(lái)源于泡盛曲霉的普魯蘭酶。經(jīng)過(guò)一系列的分離純化,得到了電泳純的普魯蘭酶。PulXF在高溫下催化活性和穩(wěn)定性顯示較高優(yōu)勢(shì)。在偏酸性的環(huán)境下酶活力保持80%以上。在有機(jī)溶劑、表面活性劑等苛刻環(huán)境中,仍具有很好的耐受性。底物的特異性實(shí)驗(yàn)顯示PulXF對(duì)含有α-1,6-糖苷鍵的糖類(lèi)有專(zhuān)一性的催化作用,Km為較低,表明對(duì)普魯蘭糖有強(qiáng)的親和性,屬于典型的I型普魯蘭酶?？傮w而言,本研究從泡盛曲霉分離純化的I型普魯蘭酶在耐熱性、酸堿穩(wěn)定型、有機(jī)溶劑、表面活性劑穩(wěn)定性等方面,表現(xiàn)出強(qiáng)的穩(wěn)定性和高活性,很有希望應(yīng)用于淀粉加工、洗滌劑、微生物發(fā)酵、生物能源等領(lǐng)域。