灰樹花子實體中 水溶性碳水化合物的提取與純化

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(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122; 2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

灰樹花是一種珍稀的食、藥兼用大型真菌,屬于多孔菌屬,具有強化脾臟[1]、潤肺保肝[2]的功效。灰樹花富含碳水化合物(含量約為50%)、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和酚類化合物,脂肪含量較低[3-4]。日本在1982年首次實現(xiàn)了大規(guī)模灰樹花商業(yè)生產(chǎn)[5],至1999年種植面積近4萬頃;上世紀(jì)90年代,美國和中國也開始了大規(guī)模人工培育,2001年中國灰樹花種植面積為1.46萬頃[6-7]。

灰樹花子實體和液體培養(yǎng)菌絲體含有許多活性物質(zhì)。1984年Ohno等[8]首先指出灰樹花多糖具有抗腫瘤活性;1992年美國國家癌癥研究院證實灰樹花的萃取物有抵抗艾滋病病毒的功效[9];2002年,Kodama等[10]對22～57歲年齡段的腫瘤患者服用灰樹花多糖后的療效進行了調(diào)查,結(jié)果表明灰樹花多糖對不同腫瘤的活性不同。2015年,Xiao等[11]發(fā)現(xiàn)，灰樹花多糖通過提高胰島素敏感性,提高磷酸化IR蛋白水平(Try1361)和磷酸化IRS-1水平(Ser307),降低空腹血糖水平。Chen等[12]在體外試驗中證明:G. frondosa多糖對DPPH,羥基和超氧化物自由基有清除作用,以及還原能力、亞鐵離子螯合作用和抑制大鼠肝臟脂質(zhì)氧化的能力。但目前對于灰樹花中低聚糖的報道較少。

本文進行了灰樹花中水溶性碳水化合物的提取、純化分離和低聚糖的結(jié)構(gòu)鑒定。首先常溫(30 ℃)提取可溶性糖(單糖和低聚糖),然后對可溶性糖進行分離純化和核磁鑒定。對可溶性多糖進行凝膠色譜柱分離并測定了分子量分布。另外,對灰樹花原料及提取過程中的結(jié)構(gòu)變化進行了SEM表征,以期為多糖高溫提取方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹花子實體 浙江慶元高山農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)商部;木瓜蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司;732陽離子交換樹脂和D-葡萄糖(AR) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%) 阿拉丁;血糖測定試劑盒 北京利德曼生化技術(shù)有限公司;D392弱堿性陰離子交換樹脂和711陰離子交換樹脂 天津南開和成科技有限公司;SephadexTMG-25、SephadexTMG-75 GE Healthcare Bio-Sciences AB;Dextran系列標(biāo)品 Sigma公司;Shodex Stangdard P-82標(biāo)品 Shodex公司。

UV-1100型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;DHL-A電腦數(shù)顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠;SBS-100數(shù)控記滴自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠;LGC-1025 COLUMN HEATER、1525高效液相色譜儀(配2410示差折光檢測器和Empower工作站)、UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mmid×2)、Sugar-PakTM-I(300 mm×6.5 mm) 美國Waters公司;SUGAR KS-803 和KS-804(300 mm×8.0 mm) Shodex公司;L-2000高效液相色譜儀 日本Hitachi電子公司;Dionex ICS-5000離子色譜儀 美國Dionex公司;AVANCE Ⅲ 400HZ全數(shù)字化核磁共振儀 德國Bruker Biospin公司。SU1510掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 灰樹花水溶性碳水化合物的提取 灰樹花子實體粉碎過80目篩,稱取50 g粉末于夾套反應(yīng)器中,按一定料液比加入去離子水,添加一定量木瓜蛋白酶,先于50 ℃酶解反應(yīng)1 h,100 ℃滅酶10 min,再在一定溫度下機械攪拌一定時間后,5000 r/min離心15 min,得上清液Ⅰ。渣相Ⅰ中加入300 mL去離子水,在高壓反應(yīng)釜中130 ℃下反應(yīng)4 h,之后5000 r/min離心15 min,去離子水清洗渣相三次,合并上清液,抽濾2次,濾液中加入4倍體積的無水乙醇于4 ℃靜置12 h,5000 r/min離心15 min,無水乙醇清洗渣相,待乙醇揮發(fā)干凈,凍干(0.04 Mbar,-50 ℃)得粗多糖。粗多糖得率(X%)根據(jù)式(1)計算:

式(1)

式中,m1為凍干所得粗多糖質(zhì)量(g);m2為原料子實體干重(g)。

1.2.2 可溶性糖提取純化及結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.2.1 可溶性糖提取的單因素實驗 分別考察料液比(w/v,1∶15、1∶20和1∶30 g/mL)、木瓜蛋白酶的添加量(0、0.2%和0.4%)、溫度(30、60、70和80 ℃)和反應(yīng)時間(1、2、3和4 h)4個因素作單因素實驗,考察各個單因素對可溶性糖得率的影響。將其中一個作為單因素時,其他三個因素的固定實驗水平分別是料液比1∶20 g/mL、溫度30 ℃、反應(yīng)時間2 h和加酶量0.2%。采用苯酚硫酸法[13]測定總糖含量,以總糖含量大小反映可溶性糖的得率;用無水葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=11.352x+0.0055(R2=0.9993)?？扇苄蕴堑寐矢鶕?jù)式(2)計算:

可溶性糖得率(%)=[總糖濃度(mg/mL)×上清液Ⅰ體積(mL)]/子實體干重(mg)×100

式(2)

1.2.2.2 分子量表征 采用高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)測量浸提液中碳水化合物的分子量分布。將30、60、80和130 ℃不同溫度提取得到的浸提液,10000 r/min離心10 min,0.45 μm過濾器過濾后進樣。色譜條件:色譜柱UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mm);流動相0.05 mol/L NaNO3;流速0.9 mL/min;柱溫30 ℃。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=13.6-0.559x(R2=0.9974)(其中x為保留時間,min;y為lg(Mp))。

1.2.2.3 可溶性糖純化 取150 mL水酶法提取得到的上清液Ⅰ,向其中加入15 g 732樹脂,20 ℃下200 r/min靜態(tài)吸附30 min后抽濾,取濾液,向其中添加15 g 711樹脂,20 ℃下200 r/min靜態(tài)吸附30 min后抽濾,取濾液,再向其中添加2 g 732樹脂和4 g 711樹脂,20 ℃下200 r/min靜態(tài)吸附15 min脫除殘余鹽分。最后向濾液中加入20 g D392樹脂,在60 ℃下200 r/min脫色2 h得到無色澄清溶液,命名為純化液。將純化液濃縮至原體積的1/4,得到濃縮液。分別測定上清液Ⅰ、純化液和濃縮液的固形物含量、含鹽量、色素和蛋白質(zhì)含量(其中,用分光光度計A420處的吸光值表示色素含量[14];凱氏定氮法測定蛋白含量[15],換算系數(shù)4.38[16];阿貝折光儀測定固形物含量;電導(dǎo)率儀測定溶液電導(dǎo)率,用以表示溶液中鹽的情況[17])。根據(jù)式(3)和(4)分別計算脫色率(η)和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(c2):

式(3)

式中,A0和A1分別是上清液Ⅰ脫色前和脫色后在420 nm下的吸光度。

式(4)

式中,c1和v1分別為鹽酸的濃度(mol/L)和體積(mL);f為換算系數(shù);v2試樣體積。

1.2.2.4 可溶性糖的凝膠色譜層析分離 將濃縮液(總糖濃度為48.25 mg/mL)10000 r/min離心15 min,0.22 μm濾膜過濾后,用Sephadex G-25凝膠柱(10 mm×100 cm,分離范圍100～5000 Da)進行分離。柱層析條件:空水體積32 mL;上樣量2 mL;純水洗脫;洗脫速度0.1 mL/min;定滴收集2 mL/管。

1.2.2.5 HPLC分析 合并洗脫曲線相同組分進行HPLC分析。根據(jù)可溶性糖分子量分布結(jié)果,選擇水蘇糖、海藻糖、木糖、半乳糖、果糖和葡萄糖為標(biāo)品。樣品經(jīng)10000 r/min離心10 min,0.45 μm濾膜過濾后進樣。色譜條件:色譜柱Sugar-PakTM-I(6.5 mm×300 mm);去離子水為流動相;柱溫85 ℃;流速0.40 mL/min;進樣體積10 μL;示差折光檢測器。

1.2.2.6 可溶性糖中低聚糖的NMR分析 將凝膠層析收集到的單一樣品凍干(0.04 Mbar,-50 ℃),配制成濃度30 mg/mL的待測樣,進行13C和1H分析。參照物為海藻糖標(biāo)品(30 mg/mL)。核磁條件:磁場強度9.4 Tesla,碳譜的射頻頻率100 Hz,氫譜的射頻頻率400 Hz,5 mm Z梯度場正向多核探頭

1.2.2.7 可溶性糖中海藻糖含量測定 稱取2.0000 g海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品,配制成20 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。依次用水稀釋成15、10、5、2、1、0.5、0.25 mg/mL的溶液。上清液Ⅰ10000 r/min離心10 min,0.45 μm過濾器過濾后進樣,HPLC條件同1.2.2.5。以海藻糖的峰面積為橫坐標(biāo),濃度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=3×10-6x-0.079(R2=0.9993)。海藻糖含量(ω%)根據(jù)式(4)計算:

式(5)

式中,ρ是HPLC測得的海藻糖濃度(mg/mL);V為上清液Ⅰ體積(mL);f為試樣稀釋倍數(shù);m為試樣質(zhì)量(g)。

1.2.3 灰樹花多糖分離純化及分子量表征

1.2.3.1 粗多糖層析分離及純度鑒定 多糖凍干樣品配制成10 mg/mL的溶液,10000 r/min離心15 min后,上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。用Sephadex G-75凝膠(16 mm×100 cm,分離范圍1～50 kDa)分離,柱層析條件:空水體積53 mL;上樣量2 mL;純水洗脫;洗脫速度0.24 mL/min;80滴/管。苯酚-硫酸法測定總糖含量,繪制洗脫曲線。合并相同組分,HPLC分子量表征和鑒定純度,色譜條件:色譜柱Shodex SUGAR KS-803、KS-804;柱溫60 ℃;流動相0.1 mol/L NaNO3溶液;流速0.6 mL/min;檢測器示差折光檢測器。標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=9.6717-0.2156x(R2=0.9967)(其中x為保留時間,min;y為lg(Mp))。

1.2.3.2 SEM表征 取少量灰樹花子實體原料粉末和凍干的渣相Ⅱ粉末(130 ℃提取離心后所得)均勻粘在導(dǎo)電膠上,噴金制樣,操作電壓為5 kV,觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性糖提取、純化及結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

2.1.1 可溶性糖提取的單因素實驗結(jié)果 圖1(a)表明,溫度為30、60、70和80 ℃時得率無顯著性差異(p>0.05),說明溫度對得率影響不大,因此采用30 ℃進行常溫提取,可溶性糖得率為21.48%,圖1(b)表明,添加少量木瓜蛋白酶可以明顯提高可溶性糖得率(p<0.05),這是因為木瓜蛋白酶能夠切斷糖與蛋白的連接,使糖容易浸出。而加酶量在0.2%與0.4%時,低聚糖得率無顯著性差異。圖1(c)表明,可溶性糖得率在料液比1∶15 g/mL時,明顯低于料液比1∶20和1∶30 g/mL的得率(p<0.05),且當(dāng)料液比高于1∶20 g/mL時可溶性糖得率無顯著性差異(p>0.05),因此可確定料液比為1∶20 g/mL。圖1(d)表明,提取時間2、3和4 h時,可溶性糖得率無顯著性差異(p>0.05),因此確定提取時間為1 h。通過單因素實驗確定總糖的提取條件為:溫度30 ℃;木瓜蛋白酶添加量0.2%;料液比1∶20 g/mL;提取時間1 h,結(jié)果表明,該工藝條件下,可溶性糖得率為23.87%。

圖1 不同提取條件對得率的影響Fig.1 Effect of different extraction conditions on the extraction yield

2.1.2 分子量表征 30、60和80 ℃所提取的可溶性糖分子量分布結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示可溶性糖的主要信號出現(xiàn)在260 Da左右,考慮到分子量分布檢測的誤差,該信號可能是單糖(180 Da)或二糖(342 Da),需要進一步驗證;在19 min附近的信號分子量為1 kDa左右,可能是聚合度為6～7的寡糖;

在17 min附近的微弱信號對應(yīng)于分子量15 kDa左右的多糖,推測其聚合度為90左右,可能是更大分子量多糖降解產(chǎn)生的碎片。隨著提取溫度升高,發(fā)現(xiàn)所得到的可溶性糖中的多糖片段含量有所升高,在圖2(c)中還發(fā)現(xiàn)了很少量分子量在760 kDa左右的多糖成分。理論上,提高溫度使分子運動加劇,使得一些在常溫下不溶的多糖變的可溶,但由于多糖分子量大且分子之間形成的氫鍵數(shù)量較多,80 ℃還不足以完全打破多糖之間的強分子相互作用而導(dǎo)致多糖溶出。圖2(d)為130 ℃下提取的可溶性糖分子量分布,可以發(fā)現(xiàn)高溫浸提時多糖的溶出程度明顯提高,包括較多分子量約為300 kDa的多糖和一些分子量約14 kDa的多糖片段,甚至出現(xiàn)了少量2×105kDa的高分子量多糖。

圖2 不同溫度浸提液中碳水化合物的分子量分布Fig.2 The Molecular weight distribution of carbohydrates in different temperature extracts注：a:30 ℃;b:60 ℃;c:80 ℃;d: 130℃。

2.1.3 可溶性糖純化 根據(jù)以上研究結(jié)果,制備了30 ℃常溫提取的上清液I,并進一步進行純化以表征鑒定其中的可溶性糖。經(jīng)樹脂脫色脫鹽后,上清液I中的色素、鹽分、蛋白和總糖的情況如表1所示,純化液的電導(dǎo)率只有119 μs/cm,根據(jù)式(3)計算得脫色率為89.43%。由于蛋白質(zhì)為帶電荷的兩性物質(zhì),脫鹽脫色過程中,蛋白質(zhì)可吸附于弱堿及弱酸性樹脂,從而被有效脫除,最終蛋白質(zhì)脫除率為93.65%。糖是一種多羥基化合物,所用離子交換樹脂也能吸附糖類,最終純化過程中糖的損失率為34.19%。

表1 上清液Ⅰ、純化液和濃縮液色素、蛋白、總糖和電導(dǎo)率情況Table 1 The content of pigment,protein,total sugar and conductivity in SupernatantⅠ,Purification and concentrate solution

2.1.4 可溶性糖的凝膠色譜層析分離 純化后的上清液I經(jīng)濃縮后在G-25凝膠柱上進行層析分離,結(jié)果如圖3所示,得到兩種組分,流出體積分別位于38 mL和75 mL,峰形對稱且分離較好。因此選擇了其中6管(第19、35、36、37、38和39管)進行HPLC分析。HPLC所用各種糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間(min)如表2所示。HPLC結(jié)果見圖4，如圖4(a)所示,第19管樣品含量低且至少包含了3個組分,可能是相對分子量較大的寡糖或多糖片段,即對應(yīng)于圖2(a)結(jié)果。第35、36和37管(圖4(b)～(d))均為單一樣品,信號位置根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品判斷為海藻糖(RT=9.38 min),且從35至37號管海藻糖含量逐漸升高。第38號管(圖4(e))對應(yīng)于G-25層析結(jié)果的峰下行位置,HPLC結(jié)果顯示其除了含有海藻糖以外,還含有葡萄糖(RT=11.95 min),另外在16 min處還有一個小信號,可能是另一種含量很少的單糖或殘余雜質(zhì)。而在第39號管(圖4(f))中可見海藻糖含量已經(jīng)低于葡萄糖,同時兩種糖的含量均明顯下降。因此可以推斷,在圖2(a)中250 Da處的信號應(yīng)該包含了海藻糖和葡萄糖,而它們在G-25層析柱中也沒有得到很好地分離,都包含在流出體積65～83 mL范圍的尖峰之中。進一步地,根據(jù)表2可初步判斷上清液Ⅰ中的低聚糖為海藻糖。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品的液相出峰時間Table 2 Peak time for standard products

圖4 不同收集管的液相圖Fig.4 The liquid phase diagram of different collecting tube注：a:管19；b:管35；c:管36；d:管37；e:管38;f:管39。

圖3 G-25的柱層析圖Fig.3 G-25 Column chromatogram

2.1.5 NMR結(jié)構(gòu)鑒定 為確證HPLC中9.38 min處物質(zhì)為海藻糖,進一步采用NMR鑒定樣品結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖5和表3所示,該化合物的各個H原子和C原子的化學(xué)位移與海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)品基本一致,且質(zhì)子數(shù)、碳原子數(shù)與海藻糖的分子式一致。其中,端基質(zhì)子δ5.20(d,J=3.8 Hz)為耦合常數(shù)3.8 Hz的二重峰,屬于D-葡萄糖的1位質(zhì)子與2位質(zhì)子呈e-α立體關(guān)系,表明為α立體構(gòu)型。二糖異頭碳位的化學(xué)位移完全一致,表明二糖分子結(jié)構(gòu)對稱。綜上,可以確定樣品為(α,α)-海藻糖。

圖5 樣品的13C(a)和1H(b)圖Fig.5 13C(a)and 1H(b)spectrum of sample

δC海藻糖標(biāo)品/樣品δH海藻糖標(biāo)品/樣品93.32/93.335.20/5.20,d,J=3.8 Hz72.62/72.623.84/3.85,m72.23/72.233.76/3.76(dd),J=11.8,5.1 Hz,1H71.12/71.123.65/3.65,dd,J=9.9,3.8 Hz69.79/69.793.45/3.45,t,J=9.4 Hz60.64/60.63-

2.1.6 可溶性糖中海藻糖的定量 上清液Ⅰ經(jīng)純化、分級、HPLC分析和NMR鑒定后,證實了上清液Ⅰ中的低聚糖為海藻糖。HPLC定量分析的結(jié)果顯示:上清液Ⅰ中海藻糖的峰面積為1133368,根據(jù)式(5)算得灰樹花中海藻糖的含量為10.98%(占干重)。

2.2 灰樹花多糖分離純化及分子量表征結(jié)果

2.2.1 多糖的提取得率 多糖提取的基本依據(jù)是多糖的結(jié)構(gòu)和溶解性。多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,因技術(shù)限制無法分析透徹,而且灰樹花多糖的相對分子質(zhì)量大,水溶解性低,大多通過氫鍵、離子鍵等與其他多糖等物質(zhì)聚合在一起,須要通過有效的方法破壞結(jié)合鍵才能實現(xiàn)多糖的提取。故利用高溫破壞多糖與其他物質(zhì)的結(jié)合鍵并提高多糖的溶解度,以增加多糖的提取率。實驗結(jié)果表明:經(jīng)高溫水提、醇沉得到的多糖得率為3.42%。

2.2.2 多糖的純化 圖6表4表明,G-75柱層析圖顯示的第一個高峰主要含有兩種多糖組分,其分子量分別為300 kDa和16 kDa。收集管23～27是分子量為318 kDa左右的多糖,收集管28～38是分子量為300 kDa和16 kDa的混合物,而且隨著流出體積的增大,分子量為16 kDa的多糖成分增多,符合凝膠分離的尺寸排阻原理。流出體積在180 mL附近的小峰,因多糖含量太低,所以無法用示差檢測器檢測到信號,根據(jù)流出時間推測其分子量為1 kDa左右的多糖組分。

圖6 G-75的柱層析圖Fig.6 G-75 Column chromatogram

收集管號峰的編號保留時間(min)分子量(kDa)相對峰面積(%)23～27119.3331810028～30119.4530088.87225.351611.1331～33119.4030858.99225.391541.0134～38119.1035720.13225.351679.87

2.2.3 掃描電子顯微鏡 圖7(a)為灰樹花子實體原料顆粒的顯微觀察照片,其表面為比較致密且粗糙的形態(tài);圖7(b)為原料放大觀察照片,可見子實體為層狀堆積結(jié)構(gòu),未見孔道結(jié)構(gòu)。圖7(c)和7(d)為高溫提取后灰樹花渣相Ⅱ的觀察圖,呈現(xiàn)多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)Michalenko等[18]報道,食用菌的細(xì)胞壁主要成分是幾丁質(zhì)、β-葡聚糖和蛋白質(zhì),細(xì)胞壁外層主要是用于抵抗外界壓力水溶性葡聚糖;內(nèi)層是作為細(xì)胞壁骨架的水不溶性葡聚糖和幾丁質(zhì)?；覙浠ㄖ械暮Ｔ逄?、葡萄糖以及部分多糖溶解后,其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)遭到一定破壞,內(nèi)部骨架暴露,整體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)疏松多孔狀態(tài)。

圖7 電子顯微鏡圖Fig.7 Electron microscopes注：原料(a):×50;原料(b):×500;水提后渣相Ⅱ(c):×50;水提后渣相(d):×500。

3 結(jié)論

灰樹花的常溫浸提液經(jīng)脫色、脫鹽和脫蛋白后,再通過凝膠過濾處理得到單一低聚糖,高效液相和核磁共振實驗得出結(jié)論:灰樹花中的低聚糖為海藻糖,含量約為10%。經(jīng)高溫處理,多糖的提取率為3.42%,凝膠過濾得到兩種單一組分的多糖,高效液相鑒定其分子量分別為300 kDa和16 kDa。本研究對灰樹花低聚糖和多糖探索為后期深入探索灰樹花碳水化合物的理化性質(zhì)和功能做了初步準(zhǔn)備。