一種G蛋白偶聯(lián)受體-趨化因子受體的表達(dá)方法

尋 陽，吳馥凌，崔蒙蒙，陳玫仰，李捷凱，劉 芳

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，廣東佛山528000）

趨化因子是一種能夠趨化細(xì)胞使其定向移動的細(xì)胞因子，與其相應(yīng)受體結(jié)合能激發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號通路，引起一系列細(xì)胞微環(huán)境變化，廣泛參與機(jī)體的生理與病理過程，與炎癥反應(yīng)、免疫防御等重要的機(jī)體功能密切相關(guān)［1］。

趨化因子受體是7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）。根據(jù)分子氨基端的半胱氨酸殘基排列順序的不同，趨化因子受體可分為CXCR，CCR，CR和CX3CR 4個亞型［2-3］。當(dāng)與趨化因子配體結(jié)合時(shí)，通過受體胞內(nèi)G蛋白結(jié)構(gòu)變化，將胞外信息傳遞到胞內(nèi)［4］，參與調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、凋亡、組織損傷等各種病理和生理過程［5］，不同亞型的趨化因子受體在人體中扮演著不同角色。近年來，趨化因子受體在腫瘤中的角色受到諸多關(guān)注，如CCR7影響腫瘤細(xì)胞生長及向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移［6］；CX3CR1在大腸癌中有表達(dá)且影響其轉(zhuǎn)歸［7］；CCL2/CCR2信號通路可參與CDb/Gr髓源細(xì)胞的數(shù)量變化，影響腫瘤負(fù)荷［8］；CCL20/CCR6影響喉癌細(xì)胞系及癌組織的增殖和轉(zhuǎn)移［9］等。為深入研究趨化因子受體在不同腫瘤中的作用，對其分子結(jié)構(gòu)的破解意義重大。隨著2010年及2014年CXCR家族中CXCR1和CXCR4的結(jié)構(gòu)問世及其相應(yīng)靶向藥物的研發(fā)［10-11］，趨化因子受體的結(jié)構(gòu)研究備受矚目。然而，由于受到其7次跨膜結(jié)構(gòu)的影響，其表達(dá)相較于一般蛋白更具挑戰(zhàn)。常用于GPCR的生物表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)。本研究將針對這3種表達(dá)系統(tǒng)對趨化因子受體的表達(dá)方法進(jìn)行綜述。

1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

在異源表達(dá)蛋白的宿主中，大腸桿菌是最為常用的宿主。然而，作為跨膜型蛋白，趨化因子受體在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，由于表達(dá)系統(tǒng)差異性容易發(fā)生錯誤折疊亦或形成包涵體［12］。另一方面，外源膜蛋白的過量表達(dá)時(shí)常會導(dǎo)致細(xì)胞毒性［12］，降低細(xì)菌的生物量，從而減少目標(biāo)蛋白的表達(dá)［13］。因此，在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，常見的方法為使趨化因子受體以融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)。例如，硫氧還（thioredoxin）蛋白的融合蛋白能夠幫助重組趨化因子受體CCR5、CX3CR1等形成二硫鍵，以增加蛋白的穩(wěn)定性［14-15］，但其生物活性和表達(dá)量仍缺乏進(jìn)一步研究。融合蛋白的使用在表達(dá)趨化因子受體外的GPCR中也十分常見，如利用GPCR-Gα融合蛋白表達(dá)孤兒G蛋白偶聯(lián)受體（oGPCR）［16］，毒蕈堿型乙酰膽堿受體(MACHR)M3-G11α融合蛋白用于研究偶聯(lián)受體M3等［17］。此外，提高膜蛋白的水溶性［18］可保證趨化因子受體的活性，如利用麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein（MBP））幫助膜蛋白正確折疊并使之嵌入細(xì)菌的細(xì)胞膜上［19-21］。2016年，CCR3以融合MBP生成MBP-CCR3的形式被成功表達(dá)［22］。

在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)趨化因子受體受到多種因素影響，如受體菌、培養(yǎng)基、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、表面活性劑等。在受體菌方面，篩選出能夠較好地表達(dá)外源蛋白并同時(shí)對蛋白過度表達(dá)產(chǎn)生的毒性有較大容忍性的細(xì)菌體至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)利用大腸桿菌TB1表達(dá)CCR3時(shí)的表達(dá)量明顯高于BL21和Top10［22］；利用BL21無法正常表達(dá)CCR5、CXCR4以及CX3CR1等受體［23］。除此之外，培養(yǎng)基的選擇也對趨化因子受體的表達(dá)［24］發(fā)揮重要作用。常用培養(yǎng)基包括LB、TB和2YT等。相較于LB和2YT，TB培養(yǎng)基含有更多的胰蛋白胨和酵母提取物，且具有較強(qiáng)的緩沖能力，可有效地穩(wěn)定培養(yǎng)基pH值。研究顯示，CCR3在TB培養(yǎng)基中表達(dá)量是在其他兩種培養(yǎng)基中表達(dá)量的10倍［22］。不僅如此，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對提高趨化因子受體在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)亦十分關(guān)鍵。研究顯示，在可溶性GST-CRH在大腸桿菌表達(dá)中，OD600為0.8時(shí)為可溶性GST-CRH表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)［25］，低于或高于0.8值時(shí)表達(dá)量降低。對于有毒性的蛋白或膜蛋白的表達(dá)，較晚的誘導(dǎo)通?？梢缘玫捷^高的表達(dá)量，這是由于蛋白毒性可能抑制宿主菌生長、造成細(xì)菌密度降低［26］。表達(dá) CCR3的最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為 OD600=0.6［22］，而表達(dá) CCR5及 CXCR4時(shí)誘導(dǎo)值低于 0.6，可能說明CCR3對細(xì)菌的毒性小于CCR5和CXCR4［27］。最后，表面活性劑在趨化因子受體研究的后期純化、和結(jié)晶中扮演重要角色，篩選適合的表面活性劑除了具有增溶作用［28］還能保持目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定和溶液中的單體狀態(tài)［29-30］。

趨化因子受體在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)需要精心設(shè)計(jì)，在菌種選擇、培養(yǎng)基選擇、誘導(dǎo)劑時(shí)機(jī)、表面活性劑條件上需要進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)摸索，篩選出最佳表達(dá)方案。然而，由于大腸桿菌是原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，缺乏翻譯后修飾以及可能存在錯誤折疊等因素導(dǎo)致制備出的蛋白不具有生物學(xué)活性［31-32］，因此，時(shí)常需要運(yùn)用其他的具備完整的表達(dá)系統(tǒng)，能夠完成整個蛋白表達(dá)過程的真核細(xì)胞表達(dá)體系。

2 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

選擇哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠避免上述在大腸桿菌內(nèi)出現(xiàn)的諸如蛋白結(jié)構(gòu)錯誤、失去生物活性等問題。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有相對較完整的表達(dá)機(jī)制，能夠完成翻譯后的修飾，獲得空間結(jié)構(gòu)完整的蛋白［33］。

利用哺乳動物系統(tǒng)表達(dá)趨化因子受體首先應(yīng)確定誘導(dǎo)條件，包括誘導(dǎo)劑的選擇、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等。常用于GPCR蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑為異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、阿拉伯糖、四環(huán)素等。以趨化因子受體CCR3為例［22］，不加誘導(dǎo)劑時(shí)，幾乎不表達(dá)；加入2 μg/mL四環(huán)素和5 mmol丁酸鈉誘導(dǎo)48 h后表達(dá)量明顯提高；不僅如此，改變四環(huán)素和丁酸鈉的比例對CCR3的表達(dá)量亦有影響。其次，由于受到趨化因子受體跨膜結(jié)構(gòu)的影響，蛋白在水溶液中容易聚集變性，需要表面活性劑的增溶。與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)系統(tǒng)相似，合適的表面活性劑或其混合物能夠提高表達(dá)量和提取率，同時(shí)穩(wěn)定蛋白活性。不同的趨化因子受體有其對應(yīng)的不同的表面活性劑，同一表面活性劑對不同趨化因子受體也有不同的影響。比如，Cymal 5能夠?qū)吇蜃邮荏wCCR5進(jìn)行增溶和穩(wěn)定，但是對CXCR4的增溶效果不明顯［34-35］。因此，針對不同的趨化因子受體需要分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探索，獲得最佳的表面化學(xué)劑實(shí)驗(yàn)條件。

與大腸桿菌相比，哺乳動物細(xì)胞系能夠?qū)Ρ磉_(dá)出的趨化因子受體進(jìn)行修飾，如對末端進(jìn)行磷酸化、甲基化、糖基化等，形成完整的空間結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的正確折疊和功能有重要作用［36-38］。特別是對于趨化因子受體而言，七次跨膜的復(fù)雜結(jié)構(gòu)在維持其特殊功能具有重要的作用，包括配體識別、信號傳導(dǎo)等一系列生物學(xué)反應(yīng)。

3 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

許多GPCR都是用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)［39］，其表達(dá)水平高于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，且能對受體進(jìn)行修飾。常用的昆蟲細(xì)胞系有Sf9和Sf21［40］。

利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)趨化因子受體時(shí)可以通過在培養(yǎng)基中添加不同趨化因子配體來影響受體的表達(dá)水平，例如，在Sf9系統(tǒng)中表達(dá)CXCR4以解析其分子結(jié)構(gòu)時(shí)，為了穩(wěn)定CXCR4的結(jié)構(gòu)，在表達(dá)系統(tǒng)中加入了配體CXCL12，CXCL12二聚體與CXCR4-N端連接［41］，另外，加入小分子拮抗劑IT1t和CVX15也可有效穩(wěn)定CXCR4的結(jié)構(gòu)從而達(dá)到適用于蛋白結(jié)晶的表達(dá)量［42］；在Sf9系統(tǒng)中表達(dá)M2受體時(shí)，發(fā)現(xiàn)加入拮抗劑阿托品可增加蛋白的表達(dá)量，加入激動劑乙酰膽堿或哌侖西平則降低其表達(dá)量［40］；在構(gòu)建昆蟲表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，也常以融合蛋白的形式進(jìn)行趨化因子受體表達(dá)，例如，在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)CXCR4時(shí)加入了T4 lysozyme融合蛋白以促進(jìn)CXCR4晶體的生成［43-44］。

與哺乳動物相比，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可高效表達(dá)受體，每升感染的細(xì)胞可表達(dá)1～500 mg的受體［45］，且更易研究GPCR的G-protein選擇性［46］，但受體在該系統(tǒng)中糖基化程度較低且形式單一［47］。

4 小結(jié)

綜上所述，趨化因子受體的表達(dá)重點(diǎn)在于保證趨化因子受體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定前提下，提高其表達(dá)量，然而，作為含有7次跨膜疏水α螺旋結(jié)構(gòu)的GPCR，除了制備過程比較困難外，同時(shí)還需要盡可能地保留其生物活性。因此，趨化因子受體的表達(dá)方法的研究存在一定難度。其表達(dá)是其解析分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本文通過對趨化因子表達(dá)方法進(jìn)行總結(jié)歸納，為相關(guān)基礎(chǔ)性研究提供參考依據(jù)。