乳鐵蛋白對大鼠上頜擴弓及復(fù)發(fā)過程中腭中縫骨改建的影響

程 燁 張 程 葛孟柯 李天成 陳建偉 李 煌

上頜骨橫向發(fā)育不足常常導(dǎo)致上頜牙弓狹窄、牙列擁擠、反牙合等正畸臨床中常見的錯牙合畸形。上頜擴弓是正畸治療中廣泛用于改善生長發(fā)育期兒童上頜骨橫向發(fā)育不足的手段[1]。雖然上頜擴弓可以顯著擴寬生長發(fā)育期兒童患者的上頜骨，去除擴弓裝置后的復(fù)發(fā)卻屢見不鮮[2]。如何提高上頜擴弓之后的穩(wěn)定性、減少復(fù)發(fā)量一直是正畸醫(yī)生關(guān)注的臨床問題。

在上頜擴弓的過程中，腭中縫在應(yīng)力牽張的作用下發(fā)生一系列的改建[3]，包括骨的改建和纖維組織的重新排列[4，5]。在上頜擴弓的應(yīng)力刺激下，腭中縫區(qū)域的成骨量和破骨量同時增加，一般情況下成骨量的增加多于破骨[6]。去除擴弓裝置后，成骨和破骨活動未能處于動態(tài)的穩(wěn)定狀態(tài)，成骨量不足或破骨量過多，是導(dǎo)致上頜擴弓后復(fù)發(fā)的主要原因[7]。臨床上常用的減少復(fù)發(fā)的方式是延長擴弓保持的時間，但這樣的方法不僅延長了矯治時間，降低患者的舒適度，更因為患者的配合問題常常不能得到理想的保持效果。故學(xué)者們試圖尋找一種更為積極的方式，通過增強上頜擴弓過程中的成骨活動和（或）抑制破骨活動來保持擴弓效果[8]。

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是一種鐵結(jié)合球狀糖蛋白，生理性存在于人體多種體液中，具有抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多項生理功能。除此之外，LF在骨代謝中的作用也逐漸受到關(guān)注[9]。在近年來的研究中，LF被發(fā)現(xiàn)不僅可以增強成骨前體細胞的成骨分化、促進成骨細胞的增殖、防止其凋亡[10]，還對抑制破骨細胞生成、降低破骨活性起一定的作用。所以理論上LF 干預(yù)可能可以通過在上頜擴弓過程中調(diào)節(jié)腭中縫區(qū)域的骨改建來提高上頜擴弓的穩(wěn)定性、減少復(fù)發(fā)。

與此同時，Hou 等[11]的研究發(fā)現(xiàn)LF 對大鼠骨質(zhì)的改善作用與LF 的濃度有一定的正相關(guān)，即濃度更大的LF 有更好的改善骨質(zhì)疏松的能力。Walli等[12]將LF 加入小鼠的骨髓細胞體外培養(yǎng)模型中，觀察顯示LF 只有在較高濃度下才可以抑制破骨細胞分化。故LF 對骨代謝的調(diào)節(jié)作用可能具有一定的計量依賴性[13]。

基于以上的發(fā)現(xiàn)和假設(shè)，本研究在Wistar 大鼠上頜擴弓及復(fù)發(fā)過程中采用不同濃度的LF 灌胃干預(yù)，以觀察這些濃度的LF 灌胃對大鼠上頜牙弓擴寬量、復(fù)發(fā)量以及其過程中腭中縫骨質(zhì)的影響。

資料和方法

1.動物處理及分組

24 只5 周齡雄性Wistar 大鼠（成都達碩實驗動物有限公司，中國），體重100±10g，SPF 級，用相同的基礎(chǔ)飲食、飲水飼養(yǎng)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 天后（D0），隨機分為3 組：單純擴弓組（EO），安裝擴弓裝置；擴弓+LF1 組（E+LF1），擴弓同時給予10mg/kg/d LF 溶液灌胃；擴弓+LF2 組（E+LF2），擴弓同時給予1g/kg/d LF 溶液灌胃；每組8 只大鼠。本研究動物實驗經(jīng)四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院動物倫理委員會審查批準。

用0.014 英寸澳絲彎制成有兩個平行臂的兩眼開大簧作為擴弓裝置（圖1A）。裝置兩臂對稱性打開（圖1B），測力計測得壓縮兩臂至平行時將產(chǎn)生100±5g 的對抗力，即初始擴弓力值。大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛溶液（3ml/kg體重）麻醉后，將擴弓裝置兩臂平行地安置在大鼠上頜兩側(cè)磨牙牙合面，使用Fuji ORTHO LC 光固化正畸粘接系統(tǒng)固定（圖1C）。

圖1 擴弓裝置及其在大鼠口內(nèi)安裝

7天的擴弓后（D7），每組隨機挑選4 只大鼠處死并獲取腭部標本，其余大鼠去除口內(nèi)裝置即進入復(fù)發(fā)階段。復(fù)發(fā)7 天后（D14），處死剩余的每組4 只大鼠并獲取腭部標本。

2.LF灌胃干預(yù)

用LF 粉（95%，Westland Milk products 公司，新西蘭）分別配置1mg/ml、100mg/ml 的LF 生理鹽水溶液。從D0 起，以1ml/100g 體重的標準每日定時分別給兩組大鼠灌胃：E+LF1 組使用1mg/ml LF 溶液，E+LF2 組使用100mg/ml LF 溶液；EO 組用等量的生理鹽水灌胃。

3.牙弓寬度測量

在D0 安置裝置前、D7 處死大鼠前或除去裝置后、D14 處死大鼠前分別使用游標卡尺在大鼠口內(nèi)測量大鼠上頜兩側(cè)第一磨牙腭側(cè)齦緣間的距離。

4.標本獲取及處理

大鼠采用過量麻醉配合斷頸的方式處死，剪下其上頜骨并置于4%多聚甲醛溶液中，于4℃固定48 小時后的標本洗凈即用于Micro-CT 掃描、分析。用于HE 染色的標本固定、洗凈后置于10%EDTA脫鈣液中脫鈣。之后，標本脫水、浸蠟，進行常規(guī)石蠟包埋。在大鼠第一磨牙范圍內(nèi)，垂直于腭中縫長軸對組織塊進行切片，得到3μm 厚的連續(xù)切片。

5.Micro-CT檢測

標本置于Micro-CT 掃描管中，在Micro-CT 掃描儀（Scanco Medical 公司，瑞士）載物臺上進行掃描，掃描相關(guān)參數(shù)為：電壓90kV，電流50μA，投影數(shù)450，分辨率10μm。

用VG Studio Max 軟件（Volume Graphics 公司，德國）對掃描的上頜骨及上頜牙列進行三維重建和分析。研究分析的感興趣區(qū)域位于大鼠上頜第一磨牙近遠中根尖孔間的腭中縫區(qū)域，其橫向延伸至腭中縫骨邊界兩側(cè)各200μm 的范圍（圖2AB）。利用軟件的“壁厚分析”功能描繪感興趣區(qū)域內(nèi)的腭中縫兩側(cè)骨壁，并測量兩骨壁之間的距離作為腭中縫寬度（圖2CD）。感興趣區(qū)域的其他測量參數(shù)還包括：骨體積分數(shù)（BV/TV），骨小梁數(shù)目（TbN），骨小梁厚度（TbTh），骨小梁間隙（TbSp），校正平均灰度（MGS）。為消除誤差，用測量出的MGS 除以每個標本的灰度閾值，即得到校正后的MGS，本文后續(xù)描述中將直接用MGS 表示。

6.HE染色

石蠟切片脫蠟、水洗，依次經(jīng)歷蘇木素染液染色、鹽酸酒精分色、氨水返藍以及伊紅染液染色后置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

7.統(tǒng)計學(xué)分析

圖2 Micro-CT 分析

實驗所得量化結(jié)果均以平均數(shù)±標準差的形式表示，使用SPSS 軟件對兩個時間點（D7、D14）之間的數(shù)據(jù)進行t檢驗比較；對三個實驗分組或三個時間點（D0、D7、D14）之間的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析以及Tukey’s 檢驗。P＜0.05 則被認為有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

1.牙弓寬度變化情況

牙弓寬度的測量結(jié)果顯示，D0 和D7 時3 組大鼠的牙弓寬度都沒有統(tǒng)計學(xué)差異。經(jīng)過7 天的復(fù)發(fā)期后，D14 時EO、E+LF1 兩組大鼠的牙弓寬度與擴弓結(jié)束時相比有明顯的下降；而E+LF2 組D14 的牙弓寬度明顯大于其余兩組，且與其在D7 的牙弓寬度相比沒有顯著下降（圖3）。

圖3 牙弓寬度變化情況

2.Micro-CT測量分析結(jié)果

（1）腭中縫寬度：擴弓結(jié)束時，三個組的腭中縫寬度測量值數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計學(xué)差異。D14 時EO、E+LF1 組的腭中縫寬度基本一致，而E+LF2 組腭中縫顯著窄于EO 組（圖4A）。

（2）BV/TV：在D7、D14 兩個時間點，E+LF1 組的BV/TV 稍大于EO 組，但兩者之間沒有明顯差異。E+LF2 組的BV/TV在兩個時間點都顯著大于EO 組（圖4B）。

（3）骨小梁參數(shù)：E+LF2 組的TbN在D7 和D14都顯著大于EO 組。在兩個時間點，EO、E+LF1 兩組之間的TbN 沒有統(tǒng)計學(xué)差異（圖4C）。三個實驗組在整個實驗期間TbTh 測量值都沒有明顯差異（圖4D）。于兩個觀測時間點，EO、E+LF1 兩組的TbSp 都沒有統(tǒng)計學(xué)差異，而TbSp在E+LF2 組則顯著低于EO 組（圖4E）。

（4）校正MGS D7、D14 時，E+LF1 組腭中縫骨質(zhì)的MGS 稍大于EO 組，但兩者間沒有統(tǒng)計學(xué)差異；E+LF2 組的MGS 測量值在兩個時間點都明顯大于EO 組（圖4F）。

圖4 Micro-CT 測量分析結(jié)果

3.HE染色

與EO 組相似，LF 灌胃干預(yù)的兩組大鼠腭中縫在D7 也可見明顯向兩側(cè)擴展的軟骨層，其間的纖維組織受到牽拉，中縫區(qū)域有明顯的骨膜細胞、成骨樣細胞的遷移和聚集，腭骨骨端的邊緣可見新骨的沉積；7 天的復(fù)發(fā)期后，LF 灌胃干預(yù)組大鼠腭中縫也經(jīng)過進一步改建，隨骨端邊緣新骨的繼續(xù)形成和骨膜下細胞的進一步聚集，原先的軟骨結(jié)構(gòu)基本消失（圖5）。

與EO組不同的是：LF 灌胃干預(yù)的兩組大鼠D7 時腭中縫可見更多的新骨形成；在D14 這兩組大鼠的腭中縫也可見更多的粉紅色新骨沉積，以及更多的骨膜細胞、成骨樣細胞聚集（圖5）。

圖5 HE 染色

三組大鼠的HE 染色中均未見明顯的炎癥反應(yīng)。

討 論

近年來LF在骨代謝中的作用逐漸受到關(guān)注[9]。成骨作用方面，LF 被發(fā)現(xiàn)不僅可以增強成骨前體細胞的成骨分化、促進成骨細胞的增殖，還可以防止成骨細胞的凋亡[14～16]。將成骨細胞種植在富含LF 的涂層材料上，可以檢測到成骨細胞的黏附、增殖和分化都有顯著的增強[10]。破骨作用方面，LF 被證明對抑制破骨細胞生成、降低細胞破骨活性等方面起一定的作用[16]。LF 添加入小鼠骨髓細胞培養(yǎng)基可以明顯減少新分化的破骨細胞數(shù)量[9]。

與此同時，LF 對成骨、破骨方面的作用與其作用濃度密切相關(guān)。以往的研究表明，在體內(nèi)，LF 對去勢大鼠的骨質(zhì)改善作用呈明顯的劑量依賴性[13]；在體外，只有高濃度的LF 才能抑制破骨前體細胞的破骨向分化[12]。Yoshimaki 等[17]制造大鼠的顱骨缺損模型，分別給大鼠10mg/kg 體重、100mg/kg 體重的LF 腹腔注射。結(jié)果發(fā)現(xiàn)100mg/kg 體重LF 注射組在顱骨缺損處可以觀察到更多的成骨樣細胞聚集，有更多的骨修復(fù)。另一項給予去勢大鼠不同濃度的LF灌胃的研究，LF 濃度梯度從10mg/kg 體重到2g/kg體重不等。結(jié)果表明LF 對大鼠骨質(zhì)的改善作用呈一定的計量依賴性，且只有LF 濃度達到1g/kg 體重及以上時才對破骨活動有抑制作用[11]。因此，為研究不同濃度LF 灌胃對大鼠上頜擴弓及復(fù)發(fā)過程中腭中縫骨改建的影響，我們設(shè)定的LF 灌胃濃度為10mg/kg 體重和1g/kg 體重。

HE 染色結(jié)果提示，在大鼠腭中縫正常骨改建的基礎(chǔ)上，LF 灌胃干預(yù)的兩組大鼠中縫兩端的骨板邊緣有更多的新骨形成；在機械應(yīng)力之后的骨改建階段LF 灌胃干預(yù)的兩組大鼠腭中縫有更多的骨膜細胞、成骨樣細胞聚集?？赡苁荓F 作用導(dǎo)致的這些有成骨潛力的細胞向腭中縫區(qū)域遷移，或者LF 促進了這些細胞的增殖。這可能是LF 灌胃組大鼠腭中縫更多新骨形成的原因。

Micro-CT 測量分析結(jié)果顯示，E+LF2 組的腭中縫寬度在D14 顯著小于EO 組，這可能是因為在機械牽張力結(jié)束后，大鼠腭中縫發(fā)生進一步的組織改建，而E+LF2 組大鼠在中縫兩側(cè)的骨端表面有更多的骨質(zhì)沉積。BV/TV 測量、MGS 測量都顯示E+LF2在D7、D14 兩個時間點的測量值都顯著大于EO組。這表明了1g/kg 體重的LF 灌胃導(dǎo)致了大鼠腭中縫骨質(zhì)的致密程度在兩個時間點都被明顯的增強了。而相比于EO 組，E+LF2 組的骨小梁參數(shù)TbN 測量值顯著增加、TbSp 的測量值顯著下降則提示在高濃度LF 灌胃的作用下大鼠腭中縫的骨小梁變得多而排列緊密。

有趣的是，組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)的E+LF1 組大鼠腭中縫更多的新骨形成并沒有體現(xiàn)在Micro-CT 的檢測結(jié)果中。以往的研究中也曾出現(xiàn)二者檢測結(jié)果不一致的情況：Yoshimaki 等[17]探究LF 對骨質(zhì)的修復(fù)作用時，低濃度的LF 干預(yù)組組織學(xué)染色觀察到成骨細胞的增多、成骨效應(yīng)的增強，而Micro-CT 檢測結(jié)果卻顯示與對照組沒有顯著差異，即沒有體現(xiàn)出組織學(xué)的改變。由此可以推測，E+LF1 組可能由于LF 的灌胃濃度較低，所產(chǎn)生的增強成骨活動的效應(yīng)較弱，所以導(dǎo)致組織學(xué)的改變不足以帶來Micro-CT可以檢測到的宏觀的改變。除此之外，牙弓寬度的變化則是衡量LF 對上頜擴弓及復(fù)發(fā)的影響更為宏觀且最具臨床意義的測量指標。本實驗大鼠牙弓寬度的測量顯示：三個實驗組大鼠的牙弓寬度基線是一致的，擴弓7 天后4 組大鼠的上頜擴弓量也沒有顯著差異；經(jīng)過7 天的復(fù)發(fā)期后，EO、E+LF1 兩組大鼠的牙弓寬度出現(xiàn)了明顯的復(fù)發(fā)，而E+LF2 組則較好的保持了上頜擴弓后的牙弓寬度。這樣的結(jié)果表明1g/kg 體重的LF 灌胃不能增加上頜擴弓的擴弓量，但可以較好的保持擴弓的效果，維持上頜擴弓的穩(wěn)定性。

綜上所述，LF 灌胃可以在大鼠上頜擴弓及復(fù)發(fā)的過程中促進腭中縫的新骨形成，并呈一定的計量依賴性；高濃度LF 灌胃可以在大鼠上頜擴弓及復(fù)發(fā)的過程中增強腭中縫的骨質(zhì)，減少上頜擴弓的復(fù)發(fā)量，維持上頜擴弓的穩(wěn)定性。