探討常規(guī)HPV檢測(cè)采用RNA優(yōu)勢(shì)于DNA檢測(cè)的臨床意義

馬 莉,陳建國(guó),吳白平

(1.青海省第五人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，青海 西寧810007;2.湖南省腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖南 長(zhǎng)沙410013)

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，近年來(lái)，我國(guó)宮頸癌發(fā)病率持續(xù)上升[1]。宮頸癌早期無(wú)癥狀或癥狀不明顯，癌瘤生長(zhǎng)速度緩慢，在其達(dá)到機(jī)體出現(xiàn)明顯癥狀、體征之前要經(jīng)過(guò)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，故臨床前來(lái)就診的患者往往癌腫已到晚期。早期篩查與早期診斷是宮頸癌發(fā)病的二級(jí)預(yù)防措施，能有效減低宮頸癌死亡率[2]，從而及時(shí)給予患者有效的治療。國(guó)內(nèi)外最新研究表明，高危型HPV的持續(xù)感染在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了重要角色[3]，HPV mRNA E6、E7在致癌機(jī)制中的作用則是現(xiàn)在的研究重點(diǎn)[4-6]。本研究通過(guò)檢測(cè)不同患者HPV E6/E7 mRNA與HPV DNA的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)此兩項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)意義。

1 資料與方法

1.1一般資料選取湖南省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科于2016年1月-2016年12月收治的因?qū)m頸疾病行宮頸活檢的200例患者資料，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者既往均無(wú)急性生殖道炎癥；(2)所有患者均未接受盆腔放射治療及化學(xué)治療；(3)所有患者均無(wú)其他系統(tǒng)重大疾病 ；(4)所有患者均了解實(shí)驗(yàn)相關(guān)情況，并簽署知情同意協(xié)議。收集各組患者資料，根據(jù)病理活檢結(jié)果將其分為4組，包括低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變患者(低級(jí)別組)50例，年齡23-65歲，平均(41.3±8.5)歲；高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變患者(高級(jí)別組)50例，年齡24-64歲，平均(41.9±9.2)歲；宮頸浸潤(rùn)癌患者(浸潤(rùn)癌組)50例，F(xiàn)IGO分期為Ⅰa1-Ⅲb期，年齡35-66歲，平均(42.1±9.0)歲；其他良性婦科疾病患者50例作為對(duì)照組，年齡23-66歲，平均(41.8±8.9)歲。4組患者兩兩比較，其一般資料相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 使用細(xì)胞專用刷與患者宮頸管旋轉(zhuǎn)收集宮頸口及宮頸管脫落的上皮細(xì)胞，置于含有專用細(xì)胞保存液的試管中保存待檢。

1.2.2HPV E6/E7 mRNA檢測(cè) 采用河南科帝亞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)試劑盒，按說(shuō)明書所示規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作：將待檢標(biāo)本液置于低溫離心機(jī)，以3 000 r/min的速度離心10 min后，棄去上層液體，加入裂解液和蛋白酶K，65℃孵育約1.5 h，中途振蕩混勻標(biāo)本2次，間隔30 min。將初步處理完成的待檢樣本加入96孔板，設(shè)立空白對(duì)照與陽(yáng)性質(zhì)控各2孔，加入捕獲探針，孵育30 min，再加入底物及底物催化劑，孵育30 min。經(jīng)冷光儀檢測(cè)目的mRNA數(shù)量，單位為拷貝數(shù)，拷貝數(shù)>0為陽(yáng)性。

1.2.3HPV DNA檢測(cè) 采用美國(guó)Digene公司生產(chǎn)的HPV DNA檢測(cè)試劑盒，按說(shuō)明書所示規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作：將待檢標(biāo)本液置于低溫離心機(jī)，以3 000 r/min的速度離心10 min后，棄去上層液體，加入裂解液A，70℃孵育1 h，棄去上清液，90℃水浴5 min后冰浴5 min，3 000 r/min離心5 min，取沉淀加入反應(yīng)液，37℃孵育30 min。將初步處理完成的待檢樣本加入96孔板，設(shè)立空白對(duì)照與陽(yáng)性質(zhì)控各2孔，加入捕獲探針，孵育30 min，再加入底物及底物催化劑，孵育30 min。經(jīng)冷光儀檢測(cè)出目的DNA的數(shù)量，單位為拷貝數(shù)，拷貝數(shù)>0者為陽(yáng)性。

1.3觀察指標(biāo)

記錄各組HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)與HPV DNA檢測(cè)的陽(yáng)性例數(shù)與平均拷貝數(shù)，兩兩進(jìn)行比較分析，根據(jù)其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義進(jìn)行方法評(píng)價(jià)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1HPVE6/E7mRNA檢測(cè)結(jié)果見表1，由表中數(shù)據(jù)可見，與對(duì)照組相比，低級(jí)別組，高級(jí)別組，浸潤(rùn)癌組HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性例數(shù)與拷貝數(shù)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低級(jí)別組相比，高級(jí)別組與浸潤(rùn)癌組HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性例數(shù)與拷貝數(shù)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組相比，AP<0.05；與低級(jí)別組相比，BP<0.05。

2.2HPVDNA檢測(cè)結(jié)果見表2，由表中數(shù)據(jù)可見，與對(duì)照組相比，低級(jí)別組，高級(jí)別組，浸潤(rùn)癌組HPV DNA陽(yáng)性例數(shù)與拷貝數(shù)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低級(jí)別組相比，高級(jí)別組，浸潤(rùn)癌組HPV DNA陽(yáng)性例數(shù)與拷貝數(shù)無(wú)明顯差異，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組HPV DNA檢測(cè)結(jié)果

注：與對(duì)照組相比，AP<0.05；與低級(jí)別組相比，CP>0.05。

3 討論

我國(guó)每年約有15萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例，每年約有8萬(wàn)人死于宮頸癌，其死亡率居?jì)D科腫瘤的第二位。近年來(lái)，宮頸癌新發(fā)病例數(shù)持續(xù)上升，并呈年輕化的趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)大量流行病學(xué)和病毒學(xué)研究證實(shí)，宮頸組織發(fā)生癌前病變直至發(fā)展為浸潤(rùn)性癌癥與高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染有關(guān)。HPV DNA檢測(cè)有助于發(fā)現(xiàn)患者HPV的持續(xù)感染，輔助宮頸癌及其癌前病變的早期診斷。但多數(shù)患者HPV感染具有一過(guò)性的特點(diǎn)，而從HPV感染至宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)瘤變通常需數(shù)年至數(shù)十年的病變發(fā)展，因此實(shí)際工作中，HPV DNA檢測(cè)用于預(yù)測(cè)宮頸疾病惡化風(fēng)險(xiǎn)的效果并不理想。國(guó)外相關(guān)研究表明，HPV mRNA檢測(cè)和HPV DNA 檢測(cè)陽(yáng)性似然比分別為1.1-1.9和 2.0-5.8，與HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性的結(jié)果相比，mRNA 檢測(cè)陽(yáng)性提示患者發(fā)生宮頸病變的幾率更高。

在癌變發(fā)展過(guò)程中，HPV DNA需要首先被激活，轉(zhuǎn)錄大量的E6/E7 mRNA，然后再由mRNA翻譯成相應(yīng)的癌蛋白。在宮頸癌的發(fā)展過(guò)程中，E6/E7過(guò)量表達(dá)將導(dǎo)致HPV DNA侵入宿主DNA后產(chǎn)生E6蛋白與E7蛋白，E6蛋白與抑癌蛋白P53結(jié)合，阻斷細(xì)胞凋亡，而E7蛋白與抑癌蛋白視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)結(jié)合，促使細(xì)胞無(wú)限增殖而癌變[7-9]。李劍[10]等在其研究中發(fā)現(xiàn)，宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生高危型HPV病毒的感染時(shí)，E6/E7癌基因處于復(fù)制活動(dòng)期，病灶組織病變處于轉(zhuǎn)化的活躍期，此時(shí)，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可見鏡下病灶組織E6/E7蛋白全視野彌漫陽(yáng)性。低危型HPV E6/E7蛋白在阻礙p53和pRb功能方面不如高危型的E6/E7蛋白強(qiáng)烈，與這一現(xiàn)象相關(guān)的機(jī)制尚未闡明，但國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直認(rèn)為低危型HPV感染可能僅與良性增生相關(guān)[11,12]。作為一個(gè)新的生物標(biāo)記，E6/E7 mRNA的大量表達(dá)是細(xì)胞發(fā)生高級(jí)別病變的一個(gè)信號(hào)，相比于HPV DNA，E6/E7 mRNA與宮頸癌癌變的相關(guān)性更好，也越來(lái)越受到各方的關(guān)注。

由我們的實(shí)驗(yàn)可見，與低級(jí)別組相比，高級(jí)別組與浸潤(rùn)癌組HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性例數(shù)與拷貝數(shù)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但HPV DNA檢測(cè)，低級(jí)別組，高級(jí)別組，浸潤(rùn)癌組HPV DNA陽(yáng)性例數(shù)與拷貝數(shù)兩兩相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致[13,14]。綜上所述，相比于HPV DNA檢測(cè)，HPV E6/E7 mRNA在不同級(jí)別的宮頸上皮內(nèi)瘤變患者檢測(cè)中具有更好的敏感性，提示HPV E6 /E7 mRNA更適用于評(píng)估宮頸疾病惡化風(fēng)險(xiǎn)。