Wnt2、Dv-lmRNA及蛋白表達情況與食管癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析

邵鐵良，邵一峰,馬平均

(1.平頂山市第一人民醫(yī)院 胸外科，河南 平頂山467000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院2015級基礎(chǔ)臨床10班)

食管癌極易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，但血行轉(zhuǎn)移比較少見,常見轉(zhuǎn)移部位有胃、肝、肺、腎、胸膜、腹膜、腎上腺及胰腺等,以肝、肺較為常見。此外，食管癌轉(zhuǎn)移還多見內(nèi)壁的直接擴散、浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]。Wnt2作為Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要啟動因子，可通過Wnt信號通路介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后[2]。Dv-1位于β-catenin上游，屬于Wnt信號通路的正向調(diào)節(jié)因子，其在基因到蛋白的多層次研究資料較少[3]。因此，本文對Wnt2、Dv-lmRNA及蛋白表達情況與食管癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性進行研究并探討其在臨床上應(yīng)用的意義，旨在為食管癌轉(zhuǎn)移的預(yù)防提供數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月—2016年2月我院確診的食管癌患者手術(shù)切除標(biāo)本100例(病灶組)，癌旁組織標(biāo)本50例(癌旁組)。 病灶組男性57例，女性43例，年齡35-77歲，平均年齡50.26±10.42歲；臨床TNM分期Ⅰ期25例，Ⅱ期24例，III期51例；高分化30例，中分化35例，低分化35例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例；浸潤侵及漿膜55例，未侵及漿膜45例。癌旁組男性24例，女性26例，年齡33-76歲，平均年齡49.22±11.19歲。兩組標(biāo)本患者的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn)[5](1)術(shù)前未合并其他部位疾病； (2)術(shù)后病理證實為食管癌；(3)手術(shù)方法均為食管癌根治性手術(shù)；(4)有完整規(guī)范的術(shù)后病理報告及隨訪資料。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn) (1)合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者。(2)未能完成隨訪者。(3)凝血功能障礙。(4)因其他部位腫瘤進行過放化療治療者。

1.2 檢測方法[6]

采用RT-PCR法檢測組織中Wnt2、Dv-lmRNA的水平：TRIzol法提取總RNA，具體操作按照試劑盒說明書(購于南京建成生物研究所)進行；以GAPDH為內(nèi)參后cDNA為模板擴增，Wnt2 正向引物 5′-C CTTTGTTTA TGC CATCTCCTCA G-3′，反向引物 5 ′-G CG G TTGTC CA GTCA G C G TTCTT-3 ，擴增片段長度751 bp ；Dv-l正向引物 5′-CCTGTCA TCTG TCCC ACCTG-3，反向引物 5′-GTC CA G CCCTCTCTCG TCTT-3 ′，擴增片段長度為 119 bp ；Wnt2、Dv-l擴增條件為5 min 95℃，30 s 95℃，30 s，60℃，30 s 72℃，35個循環(huán)。GAPDH以30 s 59℃退火，取5 μl擴增物瓊脂糖(2%)凝膠電泳40 min，目的基因mRNA表達量為目的基因積分光密度值/GADPH積分光密度值。

采用免疫組化法檢測組織中Wnt2、Dv-l 蛋白的表達水平：分別取食管癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本，甲醛(10%)固定，石蠟包埋后4 μm連續(xù)切片，采用SP免疫組化染色法，DAB顯色，試劑盒購于南京建成生物研究所(批次20164327，產(chǎn)品編號PW017)，實驗操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進行，PBS(0.01mol/L)代替一抗陰性對照，GLUT1兔抗人抗體為陽性對照。

再利用蛋白質(zhì)印跡法檢測Wnt2、Dv-l 蛋白表達情況：提取總蛋白后BCA法檢測濃度，電泳分離后濕轉(zhuǎn)法蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉(5%)2 h封閉，孵育(4℃)一抗過夜，洗滌后二抗孵育，ECL發(fā)光試劑曝光顯影。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[7]

1.3.1免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn) 陰性對照用PBS代替一抗進行染色，結(jié)果做為陰性；陽性對照以各抗體說明書所提供組織進行染色，Wnt2、Dv-l表達陽性細(xì)胞有淡黃色或棕黃色著色，均主要表達在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜。每例標(biāo)本在400倍光鏡下隨意選取10個視野，計數(shù)每個視野100個細(xì)胞中陽性染色的細(xì)胞數(shù)，取其平均值計算陽性百分率。采取二次計分法：先將染色按強度計分：0分無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再將陽性細(xì)胞百分比計分，0分陽性細(xì)胞為<25%，1分為25%-50%，2分為51%-75%，3分為≥75%。用染色強度得分與細(xì)胞數(shù)得分之和作為判斷表達的結(jié)果，0分為陰性(-)，1-2分為弱陽性(+)，3-4分為中等陽性(+ +)，5-6分為強陽性(+ + +)。所有病理切片均由高年資病理醫(yī)師盲法評定結(jié)果。

1.3.2RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡判定標(biāo)準(zhǔn) 分別以每例標(biāo)本W(wǎng)nt2、Dv-l 與GAPDHCt值之比，作為該例標(biāo)本目的基因mRNA的相對表達量；蛋白質(zhì)印跡曝光結(jié)果以膠片上出現(xiàn)Wnt2、Dv-l 和GAPDH內(nèi)參條帶，且GAPDH內(nèi)參基因的曝光條帶在病灶組和癌旁組灰度一樣。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組組織標(biāo)本中Wnt2、Dv-l 蛋白的表達情況

Wnt2蛋白在病灶組的表達明顯高于癌旁組(P<0.05)；Dv-l 蛋白在病灶組的表達明顯高于癌旁組(P<0.05)，見表1。

2.2 兩組組織標(biāo)本中Wnt2、Dv-l mRNA及蛋白的表達水平比較

病灶組Wnt2、Dv-l mRNA及蛋白含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)見表2；western blot結(jié)果見圖1。

表1 兩組組織標(biāo)本中Wnt2蛋白表達情況 n(例)

圖1 Wnt2、Dv-l蛋白表達水平

2.3 組織標(biāo)本中的Wnt2、Dv-l蛋白表達與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

Wnt2、Dv-l 蛋白表達和相對含量在不同性別、年齡、組織學(xué)分級間比較，均無顯著性差異(P>0.05)；Wnt2、Dv-l 蛋白的表達與患者腫瘤的臨床病理學(xué)分期、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有顯著性差異(P<0．05)，見表3。

表2 兩組標(biāo)本中Wnt2、Dv-l mRNA及蛋白相對含量比較

表3 Wnt2蛋白表達與臨床病理因素的關(guān)系

3 討論

食管癌是常見的消化道腫瘤，全世界每年約有30萬人死于食管癌。其發(fā)病率和死亡率各國差異很大。我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，每年平均病死約15萬人。男多于女，發(fā)病年齡多在40歲以上[8]。食管癌典型的癥狀為進行性咽下困難，先是難咽干的食物，繼而是半流質(zhì)食物，最后水和唾液也不能咽下，嚴(yán)重降低了患者生活質(zhì)量。因而，食管癌的早期診斷并及時給予恰當(dāng)?shù)闹委燂@得尤為重要。

隨著抑癌基因和癌基因的發(fā)現(xiàn)和研究，細(xì)胞信號通路逐漸被闡明，人類對細(xì)胞癌變的機制了解也逐漸得到了豐富，近年來的多項研究[9,10]均證明Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)并控制著諸多生理過程，參與細(xì)胞的增殖、凋亡與抗凋亡等過程。Wnt途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和發(fā)育的重要途徑，此外，該途徑與細(xì)胞癌變的關(guān)系也較為密切，上述變化可能與通路中任何成分出現(xiàn)改變或Wnt基因本身存在的變化而引發(fā)[11]。Dv-1蛋白在宮頸鱗癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤中存在異常表達，研究[13]發(fā)現(xiàn)Wnt2單克隆抗體可下調(diào)惡性黑色素瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使 Dv-1蛋白失活，進而抑制黑色素瘤體外移植瘤的生長。資料[13]顯示W(wǎng)nt途徑的異常激活主要可分為以下3類：(1)過多的Wnt信號異常活躍整個途徑導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)不必要的增殖，促進Dv-1蛋白的表達；(2)組成Wnt途徑的蛋白、基因或轉(zhuǎn)錄因子出現(xiàn)變異或被破壞導(dǎo)致局部Wnt途徑或整個途徑活躍異常，進而使Dv-1蛋白出現(xiàn)異常表達；(3)細(xì)胞內(nèi)多因素通過Wnt途徑誘發(fā)或刺激機體和細(xì)胞出現(xiàn)異常反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示W(wǎng)nt2、Dv-lmRNA及蛋白在病灶組中表達水平明顯高于癌旁組(P<0．05)；病灶組Wnt2、Dv-lmRNA及蛋白含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果說明Wnt2、Dv-l可參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展過程。研究顯示W(wǎng)nt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關(guān)重要的作用,如果這條信號通路中的關(guān)鍵蛋白發(fā)生突變，導(dǎo)致信號異?；罨涂赡苷T導(dǎo)癌癥的發(fā)生[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)Wnt2、Dv-l 蛋白的表達與患者腫瘤的組織學(xué)分化程度、臨床病理學(xué)分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有密切的聯(lián)系(P<0．05)。上述結(jié)果說明，Wnt2、Dv-l 蛋白表達與食管癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)聯(lián)。在食管癌的浸潤過程中Wnt2、Dv-l 蛋白的異常表達可導(dǎo)致食管黏膜上皮細(xì)胞的分化、增殖和凋亡出現(xiàn)異常，即表現(xiàn)出異常分化、過度增殖和凋亡減少且侵襲能力提升，進而誘發(fā)食管癌向深層和遠處進一步轉(zhuǎn)移[15]。因而，我們可認(rèn)為Wnt2、Dv-l 蛋白表達異?？商崾灸[瘤細(xì)胞的吸收和利用增加有關(guān)，其可與食管黏膜上皮細(xì)胞的異常增殖相互促進，對食管癌的轉(zhuǎn)移和侵入發(fā)揮重要作用。

綜上所述，Wnt2、Dv-lmRNA及蛋白表達與食管癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)聯(lián)。