CNOT7基因敲減通過減少HepG2細胞TGF-β 1分泌影響免疫微環(huán)境

郭舜，趙海潮，任曉靜，任崇仁，賀杰峰，趙浩亮

（山西醫(yī)科大學 1. 研究生院；2. 附屬大醫(yī)院普通外科，太原 030001）

肝細胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC） 是人類常見的惡性腫瘤之一。我國是 HCC 高發(fā)國家，HCC占全球病例總數(shù)和死亡人數(shù)的50%左右［1］。目前HCC的治療模式已從單一學科治療發(fā)展為多學科綜合治療，其中HCC的免疫治療已成為國內(nèi)外研究的熱點［2-3］。CCR4-NOT轉(zhuǎn)錄復合體亞基7 （CCR4-NOT transcription complex subunit 7，CNOT7） 是真核生物CCR4-NOT蛋白復合體的重要亞基之一［4］，參與調(diào)控多種腫瘤微環(huán)境相關蛋白的轉(zhuǎn)錄［5］。本課題組前期通過蛋白組學篩查，發(fā)現(xiàn)其在肝癌組織中顯著高表達［6］。作為免疫特惠器官，肝臟具有獨特的免疫系統(tǒng)，并參與機體局部及整體水平的免疫調(diào)節(jié)。HCC免疫微環(huán)境中富含調(diào)節(jié)性 T 細胞 （regulatory T cell，Treg） 、未成熟樹突狀細胞等免疫抑制細胞及轉(zhuǎn)化生長因子-β 1 （transforming growth factor-β 1，TGF-β 1） 、白細胞介素-10 （interleukin-10，IL-10 ） 等免疫抑制因子。這種免疫抑制的微環(huán)境也成為 HCC 容易形成免疫逃逸的重要原因之一［7］。其中，TGF-β 1作為一種多效性細胞因子，是目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤誘導產(chǎn)生的免疫抑制因子之一，在HCC 的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能［8-9］。HCC患者體內(nèi) TGF-β 1水平越高，其預后越差，并與預后不良密切相關［8-9］。自然殺傷 （natural killer，NK） 細胞是固有免疫應答的參與者，有調(diào)查結(jié)果顯示肝癌患者組織中NK細胞的數(shù)量與患者生存期長短密切相關，但是在臨床研究中，將體外擴增的NK細胞進行回輸，治療效果并不理想，這可能與肝癌免疫微環(huán)境有關［10］。本研究旨在探討CNOT7基因敲減對HepG2細胞分泌TGF-β 1的影響及其在HCC免疫微環(huán)境中的作用，為HCC的免疫治療提供一些新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

HepG2細胞和NK細胞，購自中科院細胞庫；Lipofectamine 3000、opti-MEM培養(yǎng)基、人TGF-β 1 ELISA試劑盒，購自武漢博士德公司；陰性對照質(zhì)粒、CNOT7敲減質(zhì)粒和CNOT7過表達質(zhì)粒均購自上海吉凱基因生物化學技術(shù)有限公司。

1.2 HepG2細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HepG2細胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清和青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2和37 ℃的恒溫密閉細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。規(guī)律傳代3～4 d至細胞對數(shù)生長期，按1×106/孔接種于6孔板上，孵育12～15 h后，使用Lipofectamine 3000進行轉(zhuǎn)染。根據(jù)Lipofectamine 3000說明書將實驗分為3組：陰性對照組、靶向敲減CNOT7組和過表達CNOT7組，各組設有復孔。轉(zhuǎn)染后放入37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)6 h后，分別更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48 h，收集細胞進行轉(zhuǎn)染分析，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率。采用Western blotting檢測3組細胞CNOT7蛋白、TGF-β 1蛋白和核轉(zhuǎn)錄因子-κ B （nuclear factor kappa B，NF-κ B） p65蛋白的表達。采用ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β 1水平。

1.3 Western blotting

收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，用0.25%的胰蛋白酶將細胞消化并離心收集后用預冷PBS洗滌2次，溶解在含有PMSF和蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中。BCA法測定蛋白濃度。每組取等量蛋白10 μ g與上樣緩沖液混合后，常規(guī)行SDS-PAGE凝膠電泳，取目的條帶轉(zhuǎn)膜處理，用5% 牛血清白蛋白封閉后，分別加入1∶500稀釋的CNOT 7一抗、1∶1 000稀釋的TGF-β 1一抗、1∶400稀釋的NF-κ B p65一抗以及1∶1 000稀釋的β-actin一抗4 ℃孵育過夜。次日加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBS洗膜后用ECL檢測試劑盒進行信號檢測。以β-actin蛋白作為內(nèi)參照，用ImageJ軟件測量蛋白條帶光密度值，最終結(jié)果表示為目的條帶與內(nèi)參β-actin的比值。

1.4 ELISA實驗

取各組細胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明，檢測上清液中 TGF-β 1表達水平。

1.5 細胞凋亡實驗

將轉(zhuǎn)染后3組細胞按1×106/孔接種于6孔板上，孵育過夜。NK細胞采用CD3+包被刺激24 h活化?；罨腘K細胞分別與3組細胞共培養(yǎng)。CSFE標記腫瘤細胞，7-AAD標記發(fā)生凋亡的腫瘤細胞。6 h后，流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞對NK細胞殺傷功能的敏感性。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 HepG2細胞轉(zhuǎn)染效率分析

對HepG2細胞進行轉(zhuǎn)染，通過倒置熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染效率 （圖1） ，各組細胞均發(fā)出明亮綠色熒光。采用Western blotting分析轉(zhuǎn)染效率 （圖2） 。與陰性對照組相比，靶向敲減CNOT7組CNOT7蛋白表達水平降低 （t = 7.975，P < 0.05） ，過表達CNOT7組CNOT7蛋白表達水平升高 （t = 8.017，P < 0.05） ，差異均有統(tǒng)計學意義。

2.2 HepG2細胞中CNOT7對TGF-β 1和NF-κ B p65蛋白

圖1 倒置熒光顯微鏡下細胞熒光圖像 ×200Fig.1 Fluorescence microscopy images of cells ×200

圖2 細胞轉(zhuǎn)染后HepG2細胞中CNOT7蛋白的表達Fig.2 Expression of CNOT7 in HepG2 cells after transfection

表達水平的影響

通過Western blotting分析細胞轉(zhuǎn)染后HepG2細胞中TGF-β 1和NF-κ B p65蛋白表達變化 （圖3） 。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，靶向敲減CNOT7組TGF-β 1 （t = 7.374，P < 0.05） 和NF-κ B p65蛋白 （t =4.436，P < 0.05） 表達水平顯著降低，過表達CNOT7組TGF-β 1 （t = 18.56，P < 0.05） 和NF-κ B p65蛋白 （t =4.729，P < 0.05） 表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義。

2.3 CNOT7對培養(yǎng)上清液中 TGF-β 1水平的影響

圖3 細胞轉(zhuǎn)染后HepG2細胞中TGFβ- 1和NFκ- B p65蛋白的表達Fig.3 Expression of TGF-β 1 and NFκ- B p65 in HepG2 cells after transfection

ELISA結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，靶向敲減CNOT7組細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β 1水平顯著降低（t = 15.136，P < 0.05） ，過表達CNOT7組TGF-β 1水平顯著升高 （t = 10.514，P < 0.05） ，差異均有統(tǒng)計學意義。見圖4。

圖4 培養(yǎng)上清液TGF-β 1濃度Fig.4 TGFβ- 1 concentration in culture supernatant

2.4 NK細胞對HepG2細胞殺傷能力的變化

流式細胞儀檢測NK細胞對轉(zhuǎn)染后2組細胞的殺傷能力。由圖5可見，NK細胞與轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞共培養(yǎng)后，靶向敲減CNOT7組凋亡細胞比例為29.7%，較陰性對照組14.5%顯著升高，過表達CNOT7組凋亡細胞比例為5.7%，較陰性對照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義 （P < 0.05） 。

3 討論

TGF-β 1可有多種來源，在 HCC 組織中主要由Treg細胞分泌和腫瘤細胞自身分泌。腫瘤微環(huán)境中Treg 細胞的增加，很可能主要依賴于腫瘤來源的TGF-β 1［11］。腫瘤細胞分泌的 TGF-β 1可抑制 CD8+、NK細胞的殺傷功能，并將初始的 CD4+T 細胞誘導成 Treg 細胞；導致腫瘤細胞周圍 Treg 細胞富集，分泌更多 TGF-β 1，形成腫瘤局部免疫抑制的微環(huán)境［12］。研究表明，TGF-β 1在細胞免疫和細胞凋亡過程中起重要作用。在腫瘤發(fā)展早期，TGF-β 1對腫瘤細胞起抑制作用，但是當腫瘤細胞對其抑制作用產(chǎn)生抵抗時，TGF-β 1反而會促進腫瘤進展，從而誘導腫瘤細胞遷移和侵襲，介導免疫抑制和腫瘤局部免疫微環(huán)境的改變，促進腫瘤細胞存活［13］。因此，探索腫瘤細胞高分泌 TGF-β 1的機制并通過靶向抑制其分泌，將有助于改善腫瘤的免疫微環(huán)境。

圖5 細胞轉(zhuǎn)染后NK細胞對HepG2細胞殺傷能力的變化Fig.5 Changes in the killing ability of NK cells toward HepG2 cells after transfection

本研究發(fā)現(xiàn)CNOT7基因在HepG2細胞系中能夠正向調(diào)控TGF-β 1和NF-κ B p65蛋白表達水平，提示CNOT7可能通過NF-κ B p65通路調(diào)控TGF-β 1表達水平。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，敲減CNOT7后HepG2細胞外分泌的TGF-β 1水平顯著降低。與此同時，與陰性對照組相比，CNOT7基因敲減后，HepG2細胞對NK細胞殺傷力的敏感性顯著增加。這提示CNOT7基因表達下調(diào)部分逆轉(zhuǎn)HepG2細胞對NK細胞的免疫耐受。通過檢測細胞轉(zhuǎn)染后NF-κ B p65蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)CNOT7在HepG2細胞系中顯著促進NF-κ B p65蛋白表達水平，提示CNOT7能夠通過NF-κ B p65調(diào)控TGF-β 1表達水平。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：CNOT7基因可能通過NF-κ B信號通路調(diào)控TGF-β 1的分泌水平參與了HCC免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)，同時CNOT7基因表達下調(diào)增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。CNOT7基因敲減改善HCC的免疫微環(huán)境，這可能為后續(xù)研究HCC免疫治療提供新的靶點。