Notch信號(hào)通路促進(jìn)滑膜肉瘤細(xì)胞SW982增殖和侵襲的研究

高天，余鈴，李舒，劉佳勇，白楚杰，薛瑞峰，張路，方志偉，樊征夫

（1. 北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所骨與軟組織腫瘤科，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100142； 2. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨1科，武漢 430060）

滑膜肉瘤是一種臨床上常見(jiàn)的高度惡性軟組織肉瘤，好發(fā)于青壯年且多在關(guān)節(jié)周圍［1-2］。盡管手術(shù)聯(lián)合放化療的治療手段使患者5年生存率達(dá)到60%，10年生存率仍然極低［3］。Notch信號(hào)通路是一種進(jìn)化中高度保守的跨膜受體信號(hào)通路家族，其所編碼的單鏈跨膜受體蛋白在細(xì)胞的分化、個(gè)體發(fā)育的中起關(guān)鍵作用［4］。Notch信號(hào)通路包括Notch受體、配體、修飾蛋白及靶點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子。配體與受體結(jié)合后，Notch受體發(fā)生裂解并釋放Notch受體胞內(nèi)段（Notch intracellular domain，NICD），隨后NICD進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄［5］。研究［6-8］發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路的失調(diào)控參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如血液系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、胰腺癌等。Notch信號(hào)通路對(duì)滑膜肉瘤的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究擬探討Notch通路相關(guān)蛋白在滑膜肉瘤細(xì)胞SW982中的表達(dá)狀態(tài)及Notch通路對(duì)SW982細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人滑膜肉瘤細(xì)胞株SW982購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心 （American Type Culture Collection，ATCC）。SW982細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1% 100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的L-15專用培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

NICD1過(guò)表達(dá)、CBF1-shRNA慢病毒和陰性對(duì)照病毒均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染手冊(cè)對(duì)滑膜肉瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，從而得到SW982-Notch上調(diào)、W982-Notch下調(diào)細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，用嘌呤霉素 （3 μ g/mL） 孵育48 h。篩選后的滑膜肉瘤細(xì)胞株即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞分為SW982正常對(duì)照組、SW982-Notch上調(diào)組、W982-Notch下調(diào)組和DAPT處理組。收集各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用PBS調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL。接種于96孔板中，每孔200 μ L，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后分別加入終濃度1、2、4、8 μ mol/L的DAPT，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞直接培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μ L CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度值 （optical density，OD），計(jì)算細(xì)胞增殖率，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞用L-15專用培養(yǎng)基 （含10%胎牛血清） 培養(yǎng)于6孔板上，待融合后，用滅菌槍頭劃直線，劃痕后 0～24 h，用反轉(zhuǎn)的 Olympus IX50 顯微鏡通過(guò)10 倍物鏡和Image-ProPlus軟件捕獲測(cè)量劃痕面積。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，劃痕面積越大，表示遷移能力越弱。

1.5 qPCR檢測(cè)NOTCH-1、 HES-1、 HES-5、 HEY-1基因mRNA表達(dá)水平

按照Invitrogen公司的Trizol操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，抽提完成后，加入20 μ L無(wú)RNA酶水，至完全溶解，紫外分析測(cè)定所抽提RNA的濃度。取5 μ g按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增NOTCH-1、HES-1、HES-5和HEY-1，以GAPDH為內(nèi)參照。各基因引物序列如下：NOTCH-1：5’-GGCACT TTCTGTGAGGAGGAC-3’，5’-GCAGTCAGGCGTGTT GTTCT-3’。HES-1：5’-ATTCTGGAAATGACAGTGA AGCAC-3’，5’-CACCTCGGTATTAACGCCCTC-3’。HES-5：5’-GAAGCCGGTGGTGGAGAA-3’，5’-GCTTG GAGTTGGGCTGGTG-3’。 HEY-1：5’-GAAGCAGG TAATGGAGCAAGGA-3’，5’-GAAGCGTAGTTGTTGA GATGCG-3’。GAPDH：5’-ACTTTGGTATCGTGGAA GGACTCAT-3’，5’-GTTTTTCTAGACGGCAGGTCAG G -3’。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 s，94 ℃ 30 s，-60 ℃ 30 s，-72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)； 溶解曲線條件：95 ℃ 15 s，-60 ℃ 30 s，-95 ℃ 15 s。 基因相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算。

1.6 Western blotting法檢測(cè)NOTCH-1及HES-1蛋白表達(dá)水平

取各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3 次，提取細(xì)胞蛋白并定量。取適量裂解產(chǎn)物，以1∶4比例加入樣品與緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗于4 ℃孵育4 h，TBST 洗滌20 min；加入相應(yīng)二抗于室溫孵育1 h，TBST 洗滌20 min；顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用±s表示，組間差異采用單因素方差分析，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白在滑膜肉瘤細(xì)胞SW982中表達(dá)增高

NOTCH-1受體和目的基因 HES-1、 HES-5及HEY-1 在人滑膜肉瘤細(xì)胞SW982中mRNA表達(dá)水平明顯高于正?；ぜ?xì)胞，分別較對(duì)照組提高1.67±0.36、1.75±0.48、1.56±0.21和1.62±0.25倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05，圖1A）。Western blotting結(jié)果同樣顯示，NOTCH-1蛋白和其目的基因HES-1在人滑膜肉瘤細(xì)胞SW982中表達(dá)水平顯著高于正?；ぜ?xì)胞 （圖1B）。

2.2 上調(diào)Notch信號(hào)通路對(duì)滑膜肉瘤細(xì)胞SW982增殖及侵襲的影響

圖1 正常滑膜和SW982細(xì)胞中Notch通路相關(guān)基因表達(dá)Fig.1 Expression of Notch signaling pathway related genes in normal synovial cells and SW982 cells

利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建NICD1持續(xù)表達(dá)的細(xì)胞SW982株。通過(guò)qPCR和 Western blotting 技術(shù)對(duì)NICD1表達(dá)發(fā)揮的Notch信號(hào)通路激活作用進(jìn)行驗(yàn)證。qPCR結(jié)果顯示，NOTCH-1及其靶基因HES-1，HES-5，HEY-1的mRNA表達(dá)量明顯增高，平均較對(duì)照組提高1.58±0.27倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P <0.05，圖2A）。Western blotting驗(yàn)證也發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)水平與mRNA表達(dá)相符 （圖2B）。對(duì)Notch上調(diào)細(xì)胞SW982及對(duì)照細(xì)胞SW982進(jìn)行增殖能力測(cè)定，CCK8結(jié)果顯示，24～72 h時(shí)間范圍內(nèi)Notch上調(diào)的細(xì)胞SW982增殖能力明顯強(qiáng)于對(duì)照細(xì)胞SW982，24 h、48 h及72 h較對(duì)照組分別提高1.24±0.08、1.48±0.18和1.72±0.47倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05，圖2C）。劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Notch上調(diào)的細(xì)胞SW982侵襲能力與對(duì)照細(xì)胞SW982在24h無(wú)明顯差別。但在48 h時(shí)，Notch上調(diào)的細(xì)胞SW982遷移距離明顯長(zhǎng)于對(duì)照細(xì)胞SW982 （圖2D）。

圖2 過(guò)表達(dá)NICD1上調(diào)Notch通路活性，增加SW982的增殖和侵襲能力Fig.2 The proliferation and invasion of SW982 cells were upregulated following NICD1 overexpression

2.3 下調(diào)Notch信號(hào)通路對(duì)滑膜肉瘤細(xì)胞SW982增殖及遷移的影響

利用qPCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，下調(diào)組靶基因mRNA水平僅為對(duì)照組的46.3%±10.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05，圖3A），Western blotting實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了上述結(jié)果 （圖3B）。對(duì)Notch下調(diào)的細(xì)胞SW982及對(duì)照細(xì)胞SW982進(jìn)行增殖能力測(cè)定，CCK8結(jié)果顯示，24～72 h時(shí)間范圍內(nèi)Notch下調(diào)的細(xì)胞SW982增殖能力明顯低于對(duì)照細(xì)胞SW982，24 h、48 h及72 h分別為對(duì)照組的72.3%±13.2%、57.6%±11.0%和34.6%±7.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05，圖3C）。劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Notch下調(diào)的細(xì)胞SW982遷移能力與對(duì)照細(xì)胞SW982在24 h無(wú)明顯差別，48 h時(shí)Notch下調(diào)的細(xì)胞SW982遷移距離明顯短于對(duì)照細(xì)胞SW982（圖3D）。

2.4 DAPT對(duì)滑膜肉瘤細(xì)胞SW982增殖和侵襲的影響

圖3 干擾CBF1表達(dá)下調(diào)Notch通路活性，抑制SW982的增殖和侵襲能力Fig.3 The proliferation and invasion of SW982 cells were downregulated following CBF1 knockdown

CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，用不同濃度DAPT處理后，細(xì)胞SW982在24～72 h時(shí)間范圍內(nèi)增殖受到明顯抑制，且抑制作用有明顯劑量依耐性和時(shí)間依耐性。在一定范圍內(nèi)，隨著DAPT劑量的增加 （1，2，4，8 μ mol/L） 和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞SW982增殖抑制效果明顯增加，DAPT 8 μ mol/L處理72 h的抑制率可達(dá)到87.3%±7.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05，圖4A）。

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4 μ mol/L的DAPT孵育細(xì)胞SW982 48 h后，細(xì)胞遷移的數(shù)量明顯減少。與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （圖4B）。

3 討論

在大多數(shù)滑膜肉瘤中存在特異性的染色體 t（X；18） （p11. 2；q11. 2） 易位，并在斷裂處形成融合基因SYT-SSX［9］，而這種融合基因帶來(lái)的下游改變尚不清楚。在FRANCIS等［10］的研究中，對(duì)大量的軟組織肉瘤樣本行基因表達(dá)譜分析，其中包括31 例滑膜肉瘤的樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在滑膜肉瘤中差異表達(dá)的基因參與Notch、Hh和Wnt等信號(hào)通路，其中NOTCH-1和JAG1 明顯上調(diào)。本研究結(jié)果與其一致，滑膜肉瘤細(xì)胞SW982中NOTCH-1及其下游基因HES-1、HES-5和HEY-1表達(dá)明顯高于人源滑膜細(xì)胞，提示Notch信號(hào)通路在滑膜肉瘤細(xì)胞處于激活狀態(tài)。

圖4 DAPT抑制SW982細(xì)胞的增殖和侵襲Fig.4 The proliferation and invasion of SW982 cells were downregulated by DAPT

本研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)和下調(diào)Notch信號(hào)通路，結(jié)果顯示，下調(diào)Notch信號(hào)通路后SW982細(xì)胞增殖及遷移明顯受到抑制，而上調(diào)得到的結(jié)果完全相反。磷酸酶及張力蛋白同源的基因 （phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10，PTEN） 作為抑癌基因發(fā)生突變，其與 Notch 通路的關(guān)系在多種腫瘤中得到證實(shí)。如在乳腺癌中，Notch信號(hào)通路通過(guò)下調(diào)PTEN表達(dá)水平，導(dǎo)致ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)度激活，從而參與曲妥珠單抗耐藥［11］；而在胃癌中，通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路，可上調(diào)PTEN活性，從而誘導(dǎo)胃癌G2/M細(xì)胞周期阻滯［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，滑膜肉瘤中NOTCH-1上調(diào)，推測(cè)其可能導(dǎo)致PTEN基因的降低，從而發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用。

Notch 信號(hào)通路無(wú)須第二信使，γ-分泌酶抑制劑能夠靶向阻斷活化的 Notch 受體從胞膜脫落，抑制下游靶基因激活［13-14］。在非小細(xì)胞肺癌移植瘤的模型中發(fā)現(xiàn)， γ-分泌酶抑制劑能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，且停藥后仍然發(fā)揮著抗腫瘤作用［15］。同時(shí)，研究［16］也證實(shí)γ-分泌酶抑制劑對(duì)于軟組織肉瘤具有抑制作用，如γ-分泌酶抑制劑可減少硬纖維瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，并可導(dǎo)致其細(xì)胞周期阻滯，一項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)表明γ-分泌酶抑制劑用于硬纖維瘤患者中，可取得較好的療效［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，滑膜肉瘤中Notch 通路被過(guò)激活，因此，推測(cè)其抑制劑也可能對(duì)滑膜肉瘤發(fā)揮抑制效果。為了進(jìn)一步檢測(cè)γ-分泌酶抑制劑對(duì)于滑膜肉瘤的抑制效果，本研究采用DAPT處理SW982細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其增殖受到明顯抑制。隨后對(duì)Notch信號(hào)通路是否能影響SW982細(xì)胞遷移進(jìn)行研究，與設(shè)想一致，DAPT處理SW982細(xì)胞48 h后，SW982遷移能力同樣明顯被削弱。上述結(jié)果高度提示Notch信號(hào)通路在滑膜肉瘤細(xì)胞SW982中扮演促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的角色。

盡管如此，本研究仍具有一定局限性。第一，未能將Notch信號(hào)通路抑制劑與臨床化療藥物聯(lián)合應(yīng)用觀察對(duì)滑膜肉瘤細(xì)胞SW982的影響；第二，Notch信號(hào)通路是否能影響滑膜肉瘤細(xì)胞SW982體內(nèi)的增殖和侵襲能力未知，需要后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探究；第三，Notch 本身受體及配體類型較多，本研究證實(shí)，NOTCH-1在滑膜肉瘤的增殖侵襲中發(fā)揮重要作用，但與之相關(guān)的配體尚需進(jìn)一步研究。相信隨著 Notch 分子生物學(xué)的進(jìn)一步研究，將為包括滑膜肉瘤在內(nèi)的軟組織腫瘤的診斷和治療提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。