短肽FLPNF對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

段睿，焦奧，張城碩，林建貞，石悅，張佳林

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科暨器官移植科，沈陽(yáng) 110001）

糖皮質(zhì)激素具有抗炎、免疫抑制等多種生理作用［1-2］，可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管炎等疾病的治療［3-5］。臨床應(yīng)用糖皮質(zhì)激素一般采用長(zhǎng)時(shí)間和 （或） 高劑量的全身療法，對(duì)胰島β細(xì)胞具有一定的毒性作用［6］，使其受到損傷，進(jìn)而發(fā)展成為類固醇性糖尿病。這種損傷的程度與糖皮質(zhì)激素的使用劑量和時(shí)間呈正相關(guān)。地塞米松（dexamethasone，Dexa）是常用的糖皮質(zhì)激素藥物，有研究［7-8］發(fā)現(xiàn)它可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。前期研究發(fā)現(xiàn)，短肽FLPNF對(duì)過(guò)表達(dá)人胰島淀粉樣多肽 （human islet amyloid polypeptide，hIAPP） 的大鼠胰島細(xì)胞INS-1具有一定的保護(hù)作用。但目前尚未有研究報(bào)道FLPNF是否可以對(duì)Dexa誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。本研究擬探討短肽FLPNF對(duì)Dexa誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究FLPNF對(duì)類固醇性糖尿病的防治作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS（ 北京Hyclone公司） ；Dexa，上海Sigma-Aldrich公司） ；短肽FLPNF，短肽NFGAIL（ 上海強(qiáng)耀生物科技有限公司） ；胃饑餓素（ Ghrelin，美國(guó)Anaspec公司） ；兔抗Bcl-2多克隆抗體、鼠抗Bax多克隆抗體、兔抗c-caspase-3多克隆抗體、鼠抗Glut2多克隆抗體（ 武漢Proteintech公司） ；Annexin-V-FITC-PI雙染試劑盒、增強(qiáng)型CCK-8試劑盒、一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（ 上海碧云天生物科技有限公司） ；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（ 瑞士SUNRISERC公司） ；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（ 美國(guó)BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：大鼠胰島細(xì)胞株INS-1（ 上海拜力生物科技有限公司） 為我院普外實(shí)驗(yàn)室凍存。將復(fù)蘇后的INS-1細(xì)胞添加RPMI1640培養(yǎng)基（ 10 mmol/L HEPES、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸鈉、10 μ mol/L β-巰基乙醇、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μ g/mL鏈霉素）［9］置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組：將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、Dexa組、FLPNF組、FLPNF+Dexa組、Ghrelin對(duì)照組、Ghrelin+Dexa對(duì)照組、NFGAIL對(duì)照組、NFGAIL+Dexa對(duì)照組，其中含有Ghrelin的對(duì)照組為陽(yáng)性對(duì)照組，含有NFGAIL的對(duì)照組為陰性對(duì)照組。此分組中，用于處理細(xì)胞的Dexa的濃度為100 nmol/L，短肽FLPNF、NFGAIL的濃度為200 μ mol/L，Ghrelin的濃度為100 nmol/L，F(xiàn)LPNF+Dexa組、Ghrelin+Dexa對(duì) 照 組、NFGAIL+Dexa對(duì)照組分別用FLPNF、Ghrelin、NFGAIL預(yù)處理細(xì)胞24 h，再添加Dexa。該分組用于方法1.2.3（3）、1.2.4、1.2.5、1.2.6及1.2.7部分。

1.2.3 CCK-8法測(cè)定INS-1細(xì)胞活力：（ 1） 為了探究Dexa與FLPNF的先后添加順序?qū)NS-1細(xì)胞活力的影響，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種至96孔板（ 5×103/孔），每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞分為空白對(duì)照（ Control） 組、Dexa組、FLPNF組、FLPNF+Dexa組、Dexa 48 h+Control 72 h組、Dexa 48 h+FLPNF 72 h組、Control 72 h+Dexa 48 h組、FLPNF 72 h+Dexa 48 h組，其中FLPNF+Dexa組采用FLPNF與Dexa同時(shí)處理細(xì)胞的方式添加，其余組按時(shí)間順序添加，添加的處理處理因素Dexa的濃度為100 nmol/L，短肽FLPNF、NFGAIL的濃度為200 μ mol/L，Ghrelin的濃度為100 nmol/L。（ 2） 為了探究不同濃度FLPNF對(duì)INS-1細(xì)胞增殖活力的影響，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種至96孔板（1×104/孔），每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞分為空白對(duì)照（ Control） 組、Dexa組、100 μ mol/L FLPNF組、100 μ mol/L FLPNF+Dexa組、200 μ mol/L FLPNF組、200 μ mol/L FLPNF+Dexa組、400 μ mol/L FLPNF組、400 μ mol/L FLPNF+Dexa組，F(xiàn)LPNF+Dexa組用FLPNF預(yù)處理24 h，再添加Dexa。（ 3） 為檢測(cè)FLPNF與其他對(duì)照肽類對(duì)INS-1細(xì)胞活力的影響，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種至96孔板（ 1×104/孔），每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。（ 4） 各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)藥物處理后，在每孔培養(yǎng)基中加入10 μ L CCK-8溶液，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～1.5 h。待CCK-8孵育結(jié)束后，將96孔板放入酶標(biāo)儀中，測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度值。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)葡萄糖刺激胰島素分泌功能：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板（ 1×104/孔）。將INS-1細(xì)胞分為Control組、 Dexa組、 FLPNF組、 FLPNF+Dexa組，Dexa終濃度為100 nmol/L，F(xiàn)LPNF終濃度為200 μ mol/L，F(xiàn)LPNF+Dexa組先用FLPNF預(yù)處理24 h后，再添加終濃度為100 nmol/L的Dexa。藥物處理后，以PBS洗滌2次，加入不含葡萄糖的KRBH液100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，棄KRBH液，用含有低糖（ 1.1 mmol/L）或高糖（ 20 mmol/L） 的KRBH液孵育1 h，將各組樣本液體收集至離心管中，3 000r/min離心30 min，收集上清。在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品（ 50 μ L/孔），稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每孔加入樣品稀釋液40 μ L及樣品10 μ L，空白對(duì)照孔加入樣品稀釋液40 μ L及完全培養(yǎng)基10 μ L。用封口膜封閉孔口，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。棄除液體并連續(xù)洗滌5次后，加入酶標(biāo)試劑50 μ L/孔，空白對(duì)照孔中不加。封口膜封孔后，37 ℃孵育30 min后，連續(xù)洗滌5次，每孔加入顯色劑A、B各50 μ L，室溫避光靜置15 min。顯色后終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值。

1.2.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至48孔板，進(jìn)行相應(yīng)藥物處理（ 按1.2.2分組方法處理） 后，PBS洗滌1次。4%多聚甲醛常溫下固定30 min，PBS洗除固定液。加入免疫染色強(qiáng)力通透液1 mL/孔，室溫孵育5 min。將TdT酶與熒光染色液按1︰9混合成標(biāo)準(zhǔn)TUNEL檢測(cè)液。孵育后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入標(biāo)準(zhǔn)TUNEL檢測(cè)液50 μ L/孔，用封口膜將孔口封閉，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌1次。加入DAPI熒光染液100 μ L/孔，37 ℃孵育15 min。PBS洗滌2次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察和對(duì)比不同藥物作用后的細(xì)胞形態(tài)和凋亡情況。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：各組INS-1細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，用不含EDTA的胰酶消化，計(jì)數(shù)后將每組細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)至1×105/mL，每組樣品取1 mL細(xì)胞懸液，1 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌2次。將細(xì)胞重懸于195 μ L Annexin V-FITC結(jié)合液。每管樣品加入5 μ L Annexin V-FITC、10 μ L碘化丙啶染色液混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7 Western blotting檢 測(cè)Bcl-2、 Bax、 caspase-3及Glut2蛋白的表達(dá)水平：向6孔板中各組細(xì)胞加入Western及IP裂解液 （100 μ L/孔，添加1%的苯甲基磺酰氟），裂解30 min后用超聲儀勻漿。BCA法測(cè)定總蛋白濃度，煮沸5 min使蛋白變性。蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入一抗 （抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗caspase-3抗體1︰500稀釋，抗Glut2抗體1︰1 000稀釋），4 ℃過(guò)夜。室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，分別加入羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。ECL顯色，采用ImageJ 1.8.0軟件對(duì)獲取的圖像進(jìn)行分析。以β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，方差分析兩兩比較采用LSD法比較。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FLPNF對(duì)Dexa作用下INS-1細(xì)胞增殖活力的影響

如圖1A所示，與Dexa組相比，F(xiàn)LPNF+Dexa組的細(xì)胞活力明顯增高（ P < 0.001），F(xiàn)LPNF 72 h+Dexa 48 h組的細(xì)胞活力無(wú)明顯變化，Dexa 48 h+FLPNF 72 h組的細(xì)胞活力有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.001）。與FLPNF+Dexa組 比 較，Dexa 48 h+FLPNF 72 h組的細(xì)胞活力較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.01），F(xiàn)LPNF 72 h+Dexa 48 h組的細(xì)胞活力較FLPNF+Dexa組低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如圖1B所示，不同濃度（ 100、200、400 μ mol/L） FLPNF對(duì)INS-1細(xì) 胞 活 力的影響幾乎無(wú)差異；與Dexa組相比，F(xiàn)LPNF（ 100 μ mol/L） +Dexa組的細(xì)胞活力有所增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而FLPNF（ 200 μ mol/L） +Dexa組及FLPNF（ 400 μ mol/L） +Dexa組的細(xì)胞活力均有顯著增高（ P < 0.001） ；FLPNF（ 200 μ mol/L） +Dexa組與FLPNF（ 400 μ mol/L）+Dexa組的細(xì)胞活力無(wú)顯著差異。表明短肽FLPNF與Dexa共同處理細(xì)胞時(shí)，F(xiàn)LPNF的保護(hù)效果較好，發(fā)揮最佳保護(hù)作用的濃度為200 μ mol/L。

圖1 CCK-8法檢測(cè)各組INS-1細(xì)胞增殖活力Fig.1 The proliferation viability of INS-1 cells detected by CCK-8

如圖1C所示，與Control組相比，Ghrelin組、FLPNF組及NFGAIL組INS-1細(xì)胞增殖活力無(wú)明顯變化，Dexa組細(xì)胞活力則明顯降低 （P < 0.05）。與Dexa組相比，Dexa+Ghrelin組 （32.1%）、Dexa+FLPNF組 （18.7%） 的細(xì)胞活力均有顯著增加 （P < 0.001，P < 0.05），Dexa+NFGAIL組則無(wú)顯著變化 （P > 0.05）。經(jīng)過(guò)Dexa處理的INS-1細(xì)胞的活力明顯下降，而加入短肽FLPNF和Ghrelin均對(duì)Dexa誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞活力有顯著改善。

2.2 FLPNF對(duì)Dexa誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞葡萄糖刺激胰島素分泌功能的影響

如圖2A所示，低糖 （1.1 mmol/L） 條件下，F(xiàn)LPNF組、Dexa組及Dexa+FLPNF組與對(duì)照組的胰島素分泌量無(wú)顯著差異；在高糖 （20 mmol/L） 刺激下，Dexa組的胰島素分泌量顯著減少，而Dexa+FLPNF組的胰島素分泌量比Dexa組則有較為明顯的增加。如圖2B所示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)LPNF組的葡萄糖刺激胰島素分泌刺激指數(shù)無(wú)明顯變化，Dexa組則明顯降低 （P <0.001），Dexa+FLPNF組雖然比對(duì)照組有明顯降低，但比Dexa組則有明顯增加 （P < 0.05）。

2.3 短肽FLPNF對(duì)Dexa誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡的影響

圖2 FLPNF對(duì)Dexa培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞葡萄糖刺激胰島素分泌功能的影響Fig.2 Effect of FLPNF on glucose-stimulated insulin secretion in dexamethasone cultured INS-1 cells

TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果如圖3所示，空白對(duì)照組中較少見(jiàn)到細(xì)胞凋亡，相比之下，Dexa組與NFGAIL+Dexa組中細(xì)胞凋亡比例最高，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Ghrelin組、FLPNF組與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異，NFGAIL組稍有增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P >0.05）；Ghrelin+Dexa組 及FLPNF+Dexa組 能觀察 到細(xì)胞凋亡，但比Dexa組細(xì)胞凋亡均有明顯減少 （P <0.001）。

如圖4所示，Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果與TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果基本一致，空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率較低，Dexa組和NFGAIL+Dexa組細(xì)胞凋亡率明顯升高 （P < 0.001），Ghrelin組、FLPNF組、NFGAIL組與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異 （P > 0.05），Ghrelin+Dexa組及FLPNF+Dexa組的細(xì)胞凋亡率比Dexa組有明顯降低 （P < 0.001）。

2.4 短肽FLPNF對(duì)Dexa誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞Bcl-2、Bax、caspase-3及Glut2蛋白表達(dá)的影響

如圖5、6所示，Dexa組的Bcl-2、Glut-2表達(dá)水平較Control組顯著降低 （P < 0.05），經(jīng)過(guò)FLPNF短肽處理后，Dexa+FLPNF組的Bcl-2、Glut-2表達(dá)明顯升高 （P < 0.05）。相反，Dexa組的Bax、cleaved caspase-3表達(dá)水平明顯高于Control組 （P < 0.05），而Dexa+-FLPNF組的Bax、cleaved caspase-3表達(dá)較Dexa組則明顯下降 （P < 0.05）。

3 討論

糖皮質(zhì)激素盡管對(duì)炎癥性疾病、自身免疫病等多種疾病的治療與預(yù)防具有顯著成效［10-11］，但其應(yīng)用帶來(lái)的胰島并發(fā)癥不可忽視。Dexa能產(chǎn)生氧自由基，促進(jìn)胰島細(xì)胞凋亡，減弱胰島素的分泌功能［12］。前期研究結(jié)果表明，短肽FLPNF具有抗過(guò)表達(dá)hIAPP的胰島細(xì)胞凋亡的作用，這種作用可能與短肽FLPNF與胰島淀粉樣沉淀的直接結(jié)合有關(guān)，也可能與其本身的促進(jìn)增殖或抗凋亡作用有關(guān)。本研究通過(guò)Dexa誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡，證明了短肽FLPNF能直接拮抗Dexa誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡。

圖3 TUNEL法檢測(cè)短肽FLPNF對(duì)Dexa誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of oligopeptide FLPNF on dexamethasone-induced INS-1 cell apoptosis assessed by TUNEL

圖4 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig.4 Cell apoptosis detected by Annexin V-FITC/PI flow cytometry

INS-1細(xì)胞在100 nmol/L Dexa的誘導(dǎo)下出現(xiàn)增殖活力降低，在加入短肽FLPNF后，細(xì)胞增殖雖未完全恢復(fù)正常，但已有了很大程度的提升。短肽FLPNF對(duì)正常增殖狀態(tài)的INS-1細(xì)胞則無(wú)明顯的促增殖作用。相比于正常細(xì)胞，短肽FLPNF可能更容易穿過(guò)被誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞的細(xì)胞膜，因此對(duì)凋亡的INS-1細(xì)胞具有更明顯的作用。關(guān)于短肽FLPNF如何保護(hù)Dexa培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞活力的機(jī)制，可能是直接發(fā)揮促增殖的作用，也可能是通過(guò)拮抗凋亡的過(guò)程而發(fā)揮作用。本研究中，相比于先后使用短肽FLPNF或Dexa處理細(xì)胞，短肽FLPNF與Dexa同期處理細(xì)胞的方式顯示出更好的保護(hù)效果。此外，200 μ mol/L FLPNF能起到較好的保護(hù)INS-1細(xì)胞活力的作用，而100 μ mol/L FLPNF則不能發(fā)揮顯著的保護(hù)作用，400 μ mol/L FLPNF的效果與200 μ mol/L FLPNF的保護(hù)作用無(wú)顯著差異，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用了200 μ mol/L的濃度作為研究短肽FLPNF的濃度。本研究中，通過(guò)與陽(yáng)性對(duì)照肽Ghrelin、陰性對(duì)照肽NFGAIL對(duì)比發(fā)現(xiàn)，短肽FLPNF雖具有一定保護(hù)INS-1細(xì)胞活力的作用，但其作用較Ghrelin稍差，這可能與其本身的作用較弱有關(guān)，也可能與其肽鏈不穩(wěn)定有關(guān)。而相對(duì)陰性對(duì)照肽NFGAIL，F(xiàn)LPNF則有顯著的保護(hù)作用，使胰島細(xì)胞活力提升較為明顯。

圖5 Western blotting檢測(cè)INS-1細(xì)胞Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的變化Fig.5 The protein expression changes of Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 in INS-1 cells detected by Western blotting

圖6 Western blotting檢測(cè)FLPNF對(duì)Dexa培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞Glut2蛋白表達(dá)的影響Fig.6 The protein expression change of Glut2 in INS-1 cells detected by Western blotting

Glut是一類存在于細(xì)胞膜、負(fù)責(zé)由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的受體，分為Glut1、Glut2、Glut3、Glut4等幾個(gè)主要亞型，分布于不同組織器官。嚙齒類動(dòng)物胰島β細(xì)胞上主要表達(dá)Glut2，使該細(xì)胞對(duì)葡萄糖有較為敏感的反應(yīng)。當(dāng)葡萄糖濃度升高時(shí)，胰島β細(xì)胞通過(guò)Glut2攝取葡萄糖，觸發(fā)動(dòng)作電位，使胰島素釋放入血液中，進(jìn)而發(fā)揮降低血糖的作用。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用Dexa誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡的同時(shí)，胰島素受葡萄糖刺激引起排泌量減少，可能與Dexa導(dǎo)致Glut2表達(dá)下降有關(guān)。

胰島細(xì)胞功能障礙的最直接表現(xiàn)是其胰島素分泌功能的改變，胰島素分泌方式、分泌量等改變都受胰島細(xì)胞完整性的密切影響。胰島素的產(chǎn)生過(guò)程是從PPI基因轉(zhuǎn)錄成PPI mRNA，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)翻譯成胰島素前體物質(zhì)，形成胰島素原后轉(zhuǎn)移至高爾基體。當(dāng)血糖升高，Glut將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入胞，刺激胰島β細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位，由胰島素原被切割成胰島素與其他物質(zhì)，形成分泌顆粒，由胰島β細(xì)胞釋放入血，從而發(fā)揮胰島素的作用。有研究［13］發(fā)現(xiàn)，Dexa可以通過(guò)促進(jìn)Glut2翻譯后降解致Glut2蛋白表達(dá)減少，使胰島細(xì)胞對(duì)葡萄糖刺激的敏感性大幅度下降，導(dǎo)致胰島細(xì)胞內(nèi)的胰島素分泌顆粒不能正常分泌。前期蛋白組學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LPNF具有促進(jìn)Glut2表達(dá)的作用。本研究通過(guò)測(cè)定Dexa誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡的狀態(tài)下葡萄糖刺激胰島素的釋放量，證明FLPNF顯著改善了Dexa培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞的葡萄糖刺激胰島素釋放功能。

通過(guò)TUNEL法可以觀察到INS-1細(xì)胞經(jīng)不同藥物處理后的細(xì)胞核形態(tài)及凋亡情況，而通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染法則從凋亡率更具體地表現(xiàn)出不同藥物處理后細(xì)胞的凋亡數(shù)目差異。本研究結(jié)果顯示，用Dexa處理的INS-1細(xì)胞的凋亡細(xì)胞密度和凋亡率都有顯著升高，而使用短肽FLPNF處理的細(xì)胞凋亡水平則有了明顯的降低。

Dexa可通過(guò)多種途徑導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡及功能障礙。Bcl-2家族蛋白在凋亡通路中具有至關(guān)重要的作用，其中以Bcl-2與Bax蛋白的比例最為重要。Bcl-2是Bcl蛋白家族中的抗凋亡蛋白，Bax則是促凋亡蛋白，Bcl-2蛋白減少、Bax蛋白增加是凋亡通路的重要起始因素。隨著Bcl-2/Bax的比例下降，線粒體膜的通透性逐漸增加，使線粒體內(nèi)的物質(zhì)如細(xì)胞色素c外流，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡的進(jìn)展，導(dǎo)致caspase-3的升高。Dexa可通過(guò)降低Bcl-2/Bax的比例，促進(jìn)線粒體通路細(xì)胞凋亡的發(fā)生［8］。本研究中，短肽FLPNF可拮抗Dexa的線粒體通路，使Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯升高，Bax蛋白的表達(dá)明顯降低，抑制了線粒體通路的啟動(dòng)。

綜上所述，本研究以大鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞為研究對(duì)象，證實(shí)了短肽FLPNF能抑制Dexa誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其增殖，并改善胰島細(xì)胞的葡萄糖刺激胰島素分泌功能。本研究從細(xì)胞層面探討和證明了FLPNF的抗凋亡作用，可能對(duì)臨床應(yīng)用糖皮質(zhì)激素所產(chǎn)生的胰島損傷的預(yù)防和治療具有一定的臨床意義。