改良QuEChERS結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)飼料中的7種鎮(zhèn)靜劑

張 虹， 何曉明

（1.浙江財(cái)經(jīng)大學(xué)會(huì)計(jì)學(xué)院，浙江杭州 310018；2.綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江杭州 310052）

鎮(zhèn)靜劑是指對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，減弱其生理機(jī)能從而緩和激動(dòng)、消除躁動(dòng)、恢復(fù)安靜情緒的藥物（魏晉梅等，2016）。近年來(lái)，個(gè)別畜牧業(yè)飼養(yǎng)者在飼養(yǎng)過(guò)程中將鎮(zhèn)靜劑添加至動(dòng)物飼料中以達(dá)到鎮(zhèn)靜催眠、快速催肥和縮短出欄時(shí)間的目的。此外，在動(dòng)物運(yùn)輸、檢疫、屠宰前，也常使用此類(lèi)藥物以減少應(yīng)激帶來(lái)的損失（張爍等，2014）。有研究表明，殘留在動(dòng)物體內(nèi)的鎮(zhèn)靜劑會(huì)隨著食物鏈進(jìn)入人體內(nèi)，對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成不良反應(yīng)（嚴(yán)麗娟等，2013）。目前，我國(guó)明確規(guī)定在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中嚴(yán)禁添加鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，2002）。因此，建立一種快速、高效、靈敏的飼料中多種鎮(zhèn)靜劑的監(jiān)測(cè)方法對(duì)確保食品動(dòng)物質(zhì)量安全具有重要意義。

目前，鎮(zhèn)靜劑檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫法（ELISA）（李桂敏等，2014；孫文佳等，2012）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）（汪麗萍等，2005）、液相色譜法（HPLC）（羅慧玉等，2017）和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （HPLC-MS/MS）（孫珊珊等，2018；劉家陽(yáng)等，2017；朱群英等，2016）。 其中 HPLC-MS/MS法靈敏度高、選擇性和抗干擾能力強(qiáng)，成為最常用的檢測(cè)方法。

由于飼料基質(zhì)復(fù)雜，易對(duì)分析造成干擾?，F(xiàn)有的國(guó)標(biāo)方法與文獻(xiàn)報(bào)道多采用固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，雖然結(jié)果重現(xiàn)性好，但存在操作繁瑣、處理時(shí)間長(zhǎng)、成本高等問(wèn)題。QuEChERS前處理方法具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠、安全的特點(diǎn)，已被廣泛用于獸藥殘留分析（Xu等，2018；田海偉等，2017；劉永濤等，2017）。本實(shí)驗(yàn)采用增強(qiáng)型去除脂類(lèi)基質(zhì)吸附劑（EMR-Lipid）對(duì)飼料樣品進(jìn)行凈化，旨在建立飼料中7種鎮(zhèn)靜劑的測(cè)定方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 LC-MS/MS 8050三重四級(jí)桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 （日本Shimadzu公司）；ST16R高速冷凍離心機(jī) （美國(guó)Thermo公司）；Multi Reax全能型振蕩器 （德國(guó)Heidolph公司）；R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （瑞士Buchi公司）；Milli-Q Reference超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

甲酸、乙腈和甲醇（HPLC級(jí)，美國(guó)Thermo公司）；EMR-Lipid（美國(guó) Agilent公司）；石墨化炭黑（GCB）、C18 及 N-丙基乙二胺（PSA）（天津博納艾杰爾科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

氯丙嗪（純度99.2%，德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司）；地西泮、艾司唑侖、咪達(dá)唑侖、安眠酮、塞拉嗪、利血平（純度均大于95%，美國(guó)CerilliaIlt公司公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 用甲醇分別配制7種鎮(zhèn)靜劑標(biāo)準(zhǔn)品的10 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4℃下避光保存。用時(shí)根據(jù)需要用空白基質(zhì)提取液逐級(jí)稀釋配成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理 飼料樣品經(jīng)粉碎均勻后制成待測(cè)樣，于室溫下密封保存。稱(chēng)取2.0 g待測(cè)樣品于50 mL聚乙烯離心管中，加入10 mL超純水，渦旋振蕩1 min后，加入2.0 g EMR-lipid和10 mL乙腈，渦旋振蕩10 min，再加入4.0 g無(wú)水硫酸鈉和1.0 g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，8000 r/min高速冷凍離心3 min。 取上清液約8 mL置于裝有100 mg C18、50 mg PSA和200 mg無(wú)水硫酸鈉的15 mL離心管中，渦旋振蕩2 min，8000 r/min高速冷凍離心3 min。取5 mL上清液至10 mL試管中，40℃氮吹至干，用1 mL初始濃度流動(dòng)相復(fù)溶，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，上機(jī)測(cè)定。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A 相為 0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸甲醇溶液；梯度順序：0 ～ 0.5 min，10%B；0.5 ～ 2.5 min，10% ～ 25%B；2.5 ～ 5.0 min，25% ～ 95%B；5.0 ～ 6.0 min，95%B；6.0 ～ 6.5 min，95% ～ 10%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）：正離子模式；溫度：400℃；毛細(xì)管電壓：4000 V；霧化氣流量：3.0 L/min；加熱氣流量：10.0 L/min；定性與定量離子對(duì)、碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 7種鎮(zhèn)靜劑均屬于弱堿性化合物，因此選擇在正離子模式下對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。分別采用全掃描和子離子掃描方式優(yōu)化得到了母離子、子離子及各自的質(zhì)譜參數(shù)。根據(jù)EU第657/2002/EC號(hào)決議中有關(guān)規(guī)定中有關(guān)質(zhì)譜分析方法必須不少于4個(gè)識(shí)別點(diǎn)的規(guī)定，選擇兩對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)最佳的監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相應(yīng)參數(shù)作為最終質(zhì)譜采集參數(shù)，優(yōu)化的質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

表1 7種鎮(zhèn)靜劑的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水和乙腈-水2種流動(dòng)相體系在相同梯度洗脫條件下，對(duì)7種鎮(zhèn)靜劑的分離度、靈敏度和峰型的影響。使用甲醇-水體系時(shí)能獲得較好的分離效果和儀器響應(yīng)?？紤]到目標(biāo)均采用正離子模式，比較了在流動(dòng)相中加入不同濃度甲酸溶液對(duì)色譜分離和質(zhì)譜響應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入0.1%的甲酸后各目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)有顯著提高，峰型也較好，與孫珊珊等（2018）報(bào)道結(jié)果相似。最終選用0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，在優(yōu)化的條件下7種鎮(zhèn)靜劑總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖 1 7 種鎮(zhèn)靜劑（5 μg/L）的總離子流（TIC）色譜圖

2.3 提取條件優(yōu)化

2.3.1 提取條件的優(yōu)化 獸藥殘留檢測(cè)常用的提取試劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。甲醇能與水互溶，鹽析效果不佳。本實(shí)驗(yàn)比較乙腈與乙酸乙酯2種提取試劑對(duì)7種鎮(zhèn)靜劑的的提取效果。結(jié)果表明，兩者提取效果相當(dāng)，但考慮到飼料樣品中蛋白質(zhì)含量較高，乙腈具有沉淀蛋白質(zhì)的作用，能在一定程度上減少基質(zhì)效應(yīng)，因此選擇乙腈作為提取試劑。

飼料樣品中含有較多的脂肪，在提取過(guò)程中會(huì)被一起提取出來(lái)，不利于QuEChERS的凈化。參考李詩(shī)言等（2017）的方法，在鹽析提取前加入EMR-Lipid用于除去樣品中的脂類(lèi)物質(zhì)，可有效提高凈化效率。實(shí)驗(yàn)考察了EMR-Lipid添加量為0.5、1.0、2.0、3.0 g 時(shí)對(duì)樣品的凈化效果（圖 2），結(jié)果表明，當(dāng)EMR-Lipid添加量為2 g時(shí)，即可滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 EMR-Lipid添加量對(duì)7種鎮(zhèn)靜劑回收率的影響

2.3.2 凈化條件的優(yōu)化 采用乙腈和EMR-Lipid雖然去除樣品中大部分的蛋白質(zhì)和脂類(lèi)物質(zhì)，但是提取液中還殘留少量脂肪和色素等干擾組分需進(jìn)一步凈化。本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS法對(duì)樣品提取液進(jìn)行進(jìn)一步凈化。QuEChERS法常用吸附劑有GCB、C18及PSA。GCB對(duì)色素去除效果較好，但對(duì)具有平面結(jié)構(gòu)的目標(biāo)物也有較強(qiáng)的吸附作用，所以不予考慮；C18具有良好的除脂能力；PSA可有效去除色素和糖類(lèi)。本實(shí)驗(yàn)考察PSA和C18的最佳使用量 （圖3）。結(jié)果顯示，采用100 mg C18、50 mg PSA及200 mg無(wú)水硫酸鈉為凈化劑組合時(shí)，樣品可以獲得良好的凈化效果，基質(zhì)干擾小，且不會(huì)對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生明顯吸附。

圖3 不同凈化劑組合對(duì)7種鎮(zhèn)靜劑回收率的影響

2.4 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析中普遍存在，是基質(zhì)成分和目標(biāo)物在電噴霧離子源進(jìn)行離子化時(shí)相互競(jìng)爭(zhēng)所致 （周悅榕等，2017）。分別配制濃度為空白飼料基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以及對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)兩者的斜率比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。由表2可知，7種鎮(zhèn)靜劑斜率為0.583～0.801，說(shuō)明雖然經(jīng)過(guò)凈化，但由于飼料基質(zhì)復(fù)雜，部分目標(biāo)物仍存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制作用。因此本方法仍采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行校正補(bǔ)償，以消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)的干擾。

表2 7種鎮(zhèn)靜劑的線性方程、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

2.5 線性范圍和定量限 用空白飼料樣品基質(zhì)提取液配制7種鎮(zhèn)靜劑的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法下進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，7種鎮(zhèn)靜劑線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均≥0.99。

同時(shí)，以3倍信噪比確定目標(biāo)物的檢出限（LOD）為 1.1～2.8μg/kg，以 10倍信噪比確定目標(biāo)物的定量限（LOQ）為3.7～9.3μg/kg。

2.6 回收率與精密度 選取空白配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料樣品分別添加高、中、低3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平平行測(cè)定6次。結(jié)果如表3所示，7種鎮(zhèn)靜劑平均回收率為84.7%～96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2% ～10.8%，滿足GB/T 27404-2008中食品中禁用物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜0.1 mg/kg時(shí)，回收率為60%～120%的規(guī)定（中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，2008）。

表3 空白樣品中7種鎮(zhèn)靜劑的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.7 與其他方法的比較 與現(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道方法（孫珊珊等，2018；中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，2007）相比，本文建立的前處理以EMR-Lipid為吸附劑的QuEChERS方法可直接凈化提取液，有效吸附飼料中脂溶性雜質(zhì)，省去了柱活化、上樣、淋洗再洗脫的SPE過(guò)程，操作簡(jiǎn)單快速、溶劑用量小、檢測(cè)成本低，適用于大批量樣品快速檢測(cè)。。

2.8 實(shí)際樣品的分析 分別對(duì)日常送檢的配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混飼料各10份進(jìn)行7種鎮(zhèn)靜劑殘留的檢測(cè)，結(jié)果表明，所有飼料樣品均未發(fā)現(xiàn)這7種鎮(zhèn)靜劑。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將吸附劑EMR-Lipid應(yīng)用到QuECh-ERS方法中，并結(jié)合HPLC-MS/MS建立了飼料中7種鎮(zhèn)靜劑的快速檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單方便、靈敏度高、準(zhǔn)確，能滿足飼料中7種鎮(zhèn)靜劑的檢測(cè)要求，對(duì)于其他鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物也具有較高的參考價(jià)值。