HPLC法測定小葉山葡萄葉中白藜蘆醇含量

何恩銘，田 淼，沈瑞池，任育軍，汪文華

(1.福建省亞熱帶植物研究所/福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361006；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞與系統(tǒng)生物學(xué)中心，福建 福州 350002)

小葉山葡萄Vitis thunbergiivar.taiwaniana是葡萄科葡萄屬植物，又稱細(xì)本山葡萄、小本山葡萄、野葡萄等，主要分布在中國臺(tái)灣地區(qū)，是當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)中藥材，已被研制成多種保健產(chǎn)品[1]。研究發(fā)現(xiàn)，小葉山葡萄根和莖所含的白黎蘆醇[2]有抗菌[3]、抗炎[4]、抗血栓[5—6]、降脂[7]、保肝[8]、預(yù)防心血管疾病[9]、抗癌[10]、抗衰老等功效[11]，還可改善腦神經(jīng)退化性疾病，具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用[12—14]，是一種極具藥用潛力的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，市場需求較大。小葉山葡萄的傳統(tǒng)藥用部位是根和莖，葉子大多作為廢棄物處理，造成較大的浪費(fèi)。小葉山葡萄葉茂盛，葉產(chǎn)量遠(yuǎn)大于根產(chǎn)量，且可年年收獲，對(duì)葉的生物活性成分進(jìn)行分析，將葉變廢為寶，可為小葉山葡萄資源的合理利用開辟新途徑。

目前，白藜蘆醇的檢測方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、毛細(xì)管電泳法、熒光光度法、氣相色譜法和高效液相色譜法(HPLC)等[15—17]。高效液相色譜法具有分離效率快、靈敏度高、適用于檢測熱不穩(wěn)定成分等優(yōu)點(diǎn)[17]?，F(xiàn)基于HPLC法對(duì)小葉山葡萄葉中白藜蘆醇含量進(jìn)行測定，以期為小葉山葡萄資源的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：小葉山葡萄葉采收自福建省亞熱帶植物研究所小葉山葡萄苗圃，將其于60 ℃烘干48 h，粉碎過20目篩備用。

主要儀器：Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters)、UV-9100紫外-可見分光光度計(jì)(上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、Milli-Q純水機(jī)(德國Millipole)、精密電子天平、索式提取器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷卻浸提裝置、電熱恒溫水浴鍋、萬能粉碎機(jī)、烘箱、40目標(biāo)準(zhǔn)篩等。

主要試劑：白藜蘆醇對(duì)照品(98%)，購自美國Sigma公司；HPLC測試用甲醇為色譜純，提取白藜蘆醇用的甲醇為化學(xué)純，超純水為實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 方法

1.2.1 白藜蘆醇儲(chǔ)備液制備 精密稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用甲醇溶解，置于25 mL 容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻配成白藜蘆醇儲(chǔ)備液200 μg·mL-1。

1.2.2 供試品溶液制備 精確稱取小葉山葡萄粉末1 g，置于50 mL錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲波(功率150 W，頻率20 kHz)提取15 min，過濾，收集濾液；同法再提取2次，合并提取液，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，過濾即得供試品溶液。

1.2.3 檢測波長確定 分別取適量對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋至適宜濃度，以對(duì)照品溶液作空白對(duì)照，用UV-9100紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品在200～400 nm波長范圍內(nèi)全掃描，采樣間隔1 nm，中速，根據(jù)掃描吸收峰情況確定白藜蘆醇的檢測波長。

1.2.4 高效液相色譜條件 Waters高效液相色譜儀，色譜柱Hypersil C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，檢測波長306 nm，流動(dòng)相甲醇-水(72:28)，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.5 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確吸取白藜蘆醇對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻配成20 μg·mL-1對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液分別以5、10、25、50和100 μL體積進(jìn)樣，按照1.2.4色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖及峰面積。

1.2.6 白藜蘆醇測定方法學(xué)評(píng)價(jià) 按照1.2.4色譜條件，進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、加樣回收率等方法學(xué)考察試驗(yàn)，評(píng)價(jià)HPLC法測定小葉山葡萄葉中白藜蘆醇含量的效果。

1.2.7 樣品中白藜蘆醇測定 精密量取小葉山葡萄葉的提取溶液樣品10 μL，分別進(jìn)樣測定峰面積，每份溶液重復(fù)進(jìn)樣3次。用回歸方程計(jì)算各樣品中白藜蘆醇含量，結(jié)果取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中白藜蘆醇含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長

由波長200～400 nm之間掃描的紫外吸收光譜圖可以看出，白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液在306 nm處有強(qiáng)吸收峰，故選用波長306 nm作為白藜蘆醇的檢測波長(圖1)。

2.2 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照 1.2.4色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖及峰面積。以樣品含量為橫坐標(biāo) x(μg·mL-1)、峰面積y(AU·min-1)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。用最小二乘法線性回歸得白藜蘆醇回歸方程：y=73.523x+21.564，R2=0.9999。測定結(jié)果表明，白藜蘆醇對(duì)照品含量在10～200 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectrum of the reference standard

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve

2.3 高效液相色譜圖

按照1.2.4色譜條件進(jìn)行測定，白藜蘆醇對(duì)照品和小葉山葡萄葉提取液的HPLC色譜圖如圖3、圖4，二者在試驗(yàn)采用的色譜條件使白藜蘆醇的出峰時(shí)間適中，峰型較好不拖尾，其保留時(shí)間為16.25 min。

圖3 白藜蘆醇對(duì)照品HPLC色譜圖(tR=16.25 min)Fig.3 HPLC chromatogram of resveratrol control ample(tR=16.25 min)

圖4 小葉山葡萄葉提取液的HPLC色譜圖(tR=16.25 min)Fig.4 HPLC chromatogram of control sample (tR=16.25 min)

2.4 精密度試驗(yàn)

將1.2.5項(xiàng)配制的20 μg·mL-1小葉山葡萄對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，每次10 μL，結(jié)果如表1。峰面積的RSD(n=5)為0.77 %，表明儀器精密度良好。

2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取5份小葉山葡萄葉樣品粉末，每份1 g，按1.2.2方法提取白藜蘆醇，分別定容至100 mL，將供試品溶液分別進(jìn)樣20 μL，峰面積測定結(jié)果見表 2。峰面積的RSD(n=5)為 0.41%，操作方法的誤差在可接受范圍內(nèi)，說明該方法的重現(xiàn)性較好。

表 1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision test

表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of reproducibility test

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g小葉山葡萄葉樣品粉末，按1.2.2方法提取白藜蘆醇，分別定容至100 mL，于室溫(28 ℃左右)中放置，在2 h、4 h、8 h、12 h、24 h不同時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段進(jìn)樣一次，每次進(jìn)樣15 μL，然后分別按優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算得到RSD為0.21%(表3)，表明樣品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)能穩(wěn)定保存。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of stability test

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取5個(gè)10 mL容量瓶，每個(gè)容量瓶中各加入已經(jīng)測定含量的小葉山葡萄供試品溶液1 mL，再分別加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度20 μg·mL-1)，加甲醇定容至刻度，搖勻后，在2.2的色譜條件下分別進(jìn)樣，計(jì)算平均回收率。由表4可知，回收率的平均值為99.92%，RSD=0.39%，表明此方法回收率良好。

表4 加樣回收率的測定結(jié)果Table 4 Determination results of recovery

2.8 樣品中白藜蘆醇的測定

精密量取小葉山葡萄葉的提取溶液樣品10 μL，分別進(jìn)樣測定峰面積，每份溶液重復(fù)進(jìn)樣3次。用回歸方程計(jì)算各樣品中白藜蘆醇的含量，結(jié)果取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中白藜蘆醇的含量，測得小葉山葡萄葉中白藜蘆醇含量為956.43 μg·g-1DW。

3 結(jié)論

本文建立了一種高效液相色譜法(HPLC)測定小葉山葡萄葉中白藜蘆醇含量的檢測方法。色譜條件：Waters高效液相色譜儀，Hypersil C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相甲醇-水(72:28)，流速1 mL·min-1，檢測波長306 nm。在上述色譜條件下，白藜蘆醇含量在10～200 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r為0.9999，精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性RSD(n=5)分別為0.77%、0.41%、0.21%；平均加標(biāo)回收率為99.92%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.39%。該方法線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率等均達(dá)到分析實(shí)驗(yàn)要求，可用于小葉山葡萄葉中白藜蘆醇的定量和定性分析。