陽(yáng)荷根乙醇提取物的生物活性研究

白雅竹，梁 詩(shī)，陳良華，黃 雯，許傳俊，童慶宣,，林河通，明艷林

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.廈門華僑亞熱帶植物引種園/廈門市植物引種檢疫與植物源產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361002；3.福建省亞熱帶植物研究所/福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361006)

陽(yáng)荷Zingiber striolatum為姜科Zingiberaceae姜屬植物，是我國(guó)特有的藥食兩用植物資源[1—2]。民間最常食用的部位是其根部和花苞。陽(yáng)荷在我國(guó)南方有悠久的種植和食用歷史。近年來(lái)，眾多研究者研究其花苞的生物活性成分及藥理藥性[3—5]，如降血糖[6]、抗氧化[7]、抗炎抑菌[8]等。但是對(duì)陽(yáng)荷根的生物活性研究較少。俞永瓊等[9]根據(jù)《安徽中草藥》[10]中提到的“鮮陽(yáng)荷(根)搗爛外敷，干則更換，治皮膚風(fēng)疹”對(duì)陽(yáng)荷根進(jìn)行成分及藥理活性研究，采用TLC法提出陽(yáng)荷根中多種成分，但并未對(duì)這些成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和生物活性研究；馬佶等[11]用TLC法對(duì)其成分預(yù)判為酚類、皂苷、生物堿、氨基酸類物質(zhì)。王麗娜等[12]對(duì)陽(yáng)荷根進(jìn)行小鼠體內(nèi)急性毒理實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其具有較高的藥用價(jià)值。

機(jī)體在進(jìn)行新陳代謝時(shí)，不可避免地會(huì)產(chǎn)生一些多余的自由基或者接觸到亞硝酸鹽和亞硝胺。這些物質(zhì)隨著血液循環(huán)到達(dá)機(jī)體的各個(gè)部位，會(huì)使機(jī)體結(jié)構(gòu)受到破壞，造成細(xì)胞功能喪失，基因突變，甚至演變成癌癥或者壞死[13—14]。因此，本文以抗氧化、抑硝化、抗肝癌細(xì)胞為活性初篩平臺(tái)，以體系內(nèi)自由基殘余量、亞硝酸鹽和亞硝胺合成量，以及肝癌細(xì)胞的相對(duì)存活率為指標(biāo)判斷陽(yáng)荷根乙醇提取物的生物活性，進(jìn)而得出活性較好的部位。

1 材料與方法

1.1 材料

陽(yáng)荷根于2019年3月采自湖北宜昌五峰縣，由廈門華僑亞熱帶植物引種園梁詩(shī)助理研究員鑒定。采摘后清洗，經(jīng)60 ℃烘干至恒重，過(guò)40目篩，室溫避光密封保存。

主要試劑：DPPH、ABTS(分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；V?、過(guò)硫酸鉀、鹽酸、α-萘胺(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸奈乙二胺、碳酸鈉(分析純，西隴化工股份有限公司)；MTT(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

主要儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號(hào)2100，東京EYELA理化器械株式會(huì)所)；循環(huán)水式真空泵(型號(hào)SHBIII，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)(型號(hào)A聯(lián)培ha-4LDplus，德國(guó)Christ公司)；三用紫外分析儀(型號(hào)ZF-20D，上海越眾儀器設(shè)備有限公司)；酶標(biāo)儀(型號(hào)Multiskan MK3，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；倒置顯微鏡(型號(hào)DiapHot300，Olympus株式協(xié)會(huì))。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 稱取恒溫干燥后的陽(yáng)荷根粉末，以75%乙醇為提取劑，45 ℃超聲輔助提取3次(1:7、1:7、1:6)，合并提取液，旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到粗提物(ZC)。將ZC采用濕法上樣，裝入經(jīng)處理的大孔樹(shù)脂HP-20。采用梯度洗脫：將流動(dòng)相乙醇/水按0%、25%、50%、75%、95%梯度連續(xù)洗脫，每梯度沖洗3個(gè)柱體積，分別收集梯度樣品液，旋蒸凍干，得到5個(gè)樣品分別記為ZC-Ⅰ、ZC-Ⅱ、ZC-Ⅲ、ZC-Ⅳ、ZC-Ⅴ，分別配置適宜質(zhì)量濃度溶液作為供試樣品。

1.2.2 不同濃度乙醇梯度洗脫物抗氧化活性測(cè)定

1.2.2.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 方法參照Sonklin等[13]并稍作修改。取0.2 mmol·L-1DPPH乙醇溶液2 mL于5 mL離心管中，加入供試樣品2 mL。靜置15 min，在517 nm下檢測(cè)其吸光度，記為AS；用蒸餾水代替供試樣品作為空白對(duì)照，記為A0；用無(wú)水乙醇代替DPPH溶液作為本底對(duì)照，記為A1。用抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。不同梯度洗脫物作用下體系中DPPH自由基的殘余量按下式計(jì)算：

1.2.2.2 ABTS自由基清除能力測(cè)定 試驗(yàn)方法參照J(rèn)iao等[15]和趙玉靜等[16]并稍作修改。取ABTS供試液2 mL于5 mL離心管中，再加入供試樣品2 mL。靜置15 min，在734 nm下檢測(cè)其吸光度，記為AS；用蒸餾水代替供試樣品作為空白對(duì)照，記為A0；用蒸餾水代替ABTS供試液作為本底對(duì)照，記為A1。用抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。不同梯度洗脫物作用下體系中ABTS自由基的殘余量按下式計(jì)算：

1.2.3 不同濃度乙醇梯度洗脫物抑硝化活性測(cè)定

1.2.3.1 清除亞硝酸鹽能力測(cè)定 參照黃曉冬等[17]和 Choi等[18]方法并稍作修改。在玻璃試管中依次加入磷酸緩沖液(PBS，pH 3) 0.5 mL、25 μg·mL-1NaNO21 mL、供試樣品1 mL，充分震蕩后，37 ℃水浴。1 h后取出，靜置至室溫，后加入0.1%對(duì)氨基苯磺酸鈉1 mL，搖晃均勻。5 min 后加入0.01%鹽酸萘乙二胺1 mL。靜置15 min，在540 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光度，記為AS；用蒸餾水代替供試樣品作為空白對(duì)照，記為A0；用蒸餾水代替NaNO2溶液作為本底對(duì)照，記為A1。用不同濃度梯度的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。不同梯度洗脫物作用下體系中亞硝酸鹽的含量按下式計(jì)算：

1.2.3.2 阻斷亞硝胺合成能力測(cè)定 參照傅茂潤(rùn)等[19]和Liao等[20]方法并稍作修改。在玻璃試管中依次加入PBS(pH 3) 0.8 mL、50 μg·mL-1NaNO20.2 mL、二甲胺0.2 mL、供試樣品0.4 mL，充分震蕩后，37 ℃水浴。1 h后取出，加入0.5% Na2CO30.8 mL，靜置至室溫，置于365 nm紫外暗箱分析儀中照射15 min，加入1%對(duì)氨基苯磺酸鈉0.8 mL，搖晃均勻，5 min后加入0.1%鹽酸奈乙二胺0.8 mL，靜置15 min。在525 nm下檢測(cè)其吸光度，記為AS；用蒸餾水代替供試樣品作為空白對(duì)照，記為A0；用蒸餾水代替NaNO2溶液作為本底對(duì)照，記為A1。用不同濃度梯度抗壞血酸溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。不同梯度洗脫物作用下體系中亞硝胺合成阻斷率按下式計(jì)算：

1.2.4 不同濃度乙醇梯度洗脫物抗腫瘤活性測(cè)定

1.2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株 HepG2和 SMMC7721分別用含有 10%熱滅活胎牛血清(FBS)、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素的高糖培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度下恒溫培養(yǎng)。每隔1～2 d更換一次培養(yǎng)液。

1.2.4.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和SMMC7721細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至每毫升3.5×104個(gè)，分別接種于96孔板上，每孔100 μL。貼壁24 h 后，每孔加入含有不同濃度的藥物培養(yǎng)基100 μL，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組和平行試驗(yàn)組。24 h后避光加入5 mg·mL-1MTT 20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育6 h，吸棄含MTT培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜100 μL，充分震蕩并溶解生成的甲臜后在570 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，并記錄數(shù)據(jù)。每種細(xì)胞株重復(fù)3次。用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的半抑制率(IC50)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同梯度洗脫物對(duì)肝癌細(xì)胞的相對(duì)存活率按下式計(jì)算：相對(duì)存活率(%)=[1-(A對(duì)照-A加藥)/(A對(duì)照-A空白)]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度乙醇梯度洗脫物抗氧化能力

通過(guò)體外清除自由基能力分析陽(yáng)荷根乙醇提取物抗氧化能力。圖1表示陽(yáng)性對(duì)照V?在該體系中所示濃度梯度下對(duì)兩種自由基清除殘余量的大小。圖2顯示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DPPH、ABTS兩種自由基殘余量都與供試樣品濃度呈正相關(guān)。在最大濃度 5 mg·mL-1時(shí)，75%乙醇粗提物(ZC)體系下DPPH自由基的殘余量為6.88%(圖2：A)，75%乙醇粗提物經(jīng)蒸餾水洗脫部分(ZC-Ⅰ)體系下，DPPH自由基的殘余量為11.42%，對(duì)DPPH的清除效果略低于ZC(圖2：B)；50%乙醇洗脫部分(ZC-Ⅲ)在質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1時(shí)，DPPH自由基的殘存量為4.7%(圖2：D)；25%乙醇洗脫部分(ZC-Ⅱ)(圖2：C)、75%乙醇洗脫部分(ZC-Ⅳ)(圖2：E)、95%乙醇洗脫部分(ZC-Ⅴ)(圖2：F)在質(zhì)量濃度為3 mg·mL-1時(shí)，DPPH自由基的殘存量分別僅為3.85%、9.23%、5.82%。

圖1 V?對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effects of V? on DPPH and ABTS

圖2 陽(yáng)荷根乙醇粗提物及其不同濃度乙醇洗脫物的DPPH自由基清除能力Fig.2 Scavenging effects of crude extract with ethanol and its gradient elution from Zingiber striolatum root on DPPH

由圖3可得，不同濃度乙醇洗脫物對(duì)ABTS的清除效果均優(yōu)于ZC。在質(zhì)量濃度為0.8 mg·mL-1體系中，ZC清除ABTS的殘余量?jī)H為27.14%，ZC-Ⅰ、ZC-Ⅴ對(duì)ABTS的殘余量分別為24.12%、8.14%；質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1體系中，ZC-Ⅱ、ZC-Ⅲ、ZC-Ⅳ清除ABTS的殘余量分別為5.10%、0.30%、6.00%。

6種供試樣品及陽(yáng)性對(duì)照V?對(duì)DPPH、ABTS清除率達(dá)50%時(shí)的濃度(IC50)見(jiàn)表1。在試驗(yàn)體系下，陽(yáng)性對(duì)照V?對(duì)DPPH、ABTS的IC50值分別為0.012 mg·mL-1、0.001 mg·mL-1；在所有測(cè)試濃度下，陽(yáng)荷根75%乙醇粗提物經(jīng)50%乙醇洗脫部分(ZC-Ⅲ)對(duì)DPPH、ABTS的IC50值最低，分別為0.292 mg·mL-1、0.070 mg·mL-1。

圖3 陽(yáng)荷根乙醇粗提物及不同濃度乙醇洗脫物的ABTS自由基清除能力Fig.3 Scavenging effects of crude extract with ethanol and its gradient elution from Zingiber striolatum root on ABTS

表1 陽(yáng)荷根乙醇提取物及V?清除DPPH和ABTS的IC50值Table 1 IC50 values of ethanol extracts from Zingiber striolatum root and V?to remove DPPH and ABTS

2.2 不同濃度乙醇梯度洗脫物抑硝化能力

圖4為陽(yáng)性對(duì)照不同濃度V?的亞硝酸鹽含量和亞硝胺合成量大小。根據(jù)體系和樣品的溶解性，選擇 75%乙醇粗提物(ZC)及其蒸餾水洗脫部分(ZC-Ⅰ)、25%乙醇洗脫部分(ZC-Ⅱ)和 50%乙醇洗脫部分(ZC-Ⅲ)分析其對(duì)亞硝酸鹽的殘余量和對(duì)亞硝胺合成量的影響。如圖5所示，隨著藥物濃度增加，其對(duì)亞硝酸鹽的清除率和亞硝胺合成的阻斷率逐漸增大。與ZC相比，ZC-Ⅱ清除亞硝酸鹽的能力明顯增強(qiáng)，最大濃度20 mg·mL-1時(shí)體系中二者亞硝酸鹽含量分別為31.26%、16.14%；ZC-Ⅰ和ZC-Ⅲ體系下，清除亞硝酸鹽的能力相對(duì)較弱，亞硝酸鹽含量分別為53.24%、40.6%(圖5：A)。ZC-Ⅰ對(duì)亞硝胺的合成影響不大，亞硝胺含量為77.41%，另三種供試樣品ZC、ZC-Ⅱ、ZC-Ⅲ體系下的亞硝胺合成量分別為30.29%、11.06%、13.76%(圖5：B)。由表2中的IC50值可得，在所示試驗(yàn)體系下，陽(yáng)性對(duì)照V?的IC50值分別為0.391 mg·mL-1、0.0248 mg·mL-1。在所示濃度下，ZC-Ⅱ?qū)喯跛猁}的清除能力顯著高于其他三種供試樣品(P＜0.01)。四種供試樣品對(duì)亞硝酸鹽的清除能力大小順序?yàn)椋篫C-Ⅱ＞ZC＞ZC-Ⅲ＞ZC-Ⅰ；對(duì)亞硝胺合成的阻斷能力大小順序?yàn)椋篫C-Ⅱ＞ZC-Ⅲ＞ZC＞ZC-Ⅰ。

圖4 V?抑硝化能力Fig.4 Scavenging effects of V? on nitrite and the ability to block the synthesis of nitrosamine

圖5 陽(yáng)荷根乙醇提取物硝化能力比較Fig.5 Scavenging effects of extracts with ethanol from Zingiber striolatum root on nitrite and the ability to block the synthesis of nitrosamine

表2 陽(yáng)荷根乙醇提取物及V?清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的IC50值Table 2 IC50 values of nitrite scavenging ability and synthetic nitrosamine blocking ability of extracts with ethanol from Zingiber striolatum root and V?

2.3 不同濃度乙醇梯度洗脫物對(duì)肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響

2.3.1 MTT形態(tài)學(xué)觀察 兩株肝癌細(xì)胞在陽(yáng)荷根乙醇粗提物及不同濃度乙醇洗脫物處理24 h后呈現(xiàn)出不同的細(xì)胞狀態(tài)?？瞻讓?duì)照組(0 μg·mL-1)的兩株細(xì)胞HepG2和SMMC7721單層貼壁，長(zhǎng)勢(shì)較好，細(xì)胞數(shù)量多且大小均勻。經(jīng)乙醇粗提物及0%、25%、50%、75%乙醇洗脫物在其濃度0～200 μg·mL-1范圍內(nèi)處理的細(xì)胞并無(wú)明顯變化。但經(jīng)95%乙醇洗脫物(ZC-Ⅴ)處理的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞數(shù)量減少、體積縮小、從內(nèi)漲裂而死亡的現(xiàn)象，并呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴現(xiàn)象(圖6)。

圖6 陽(yáng)荷根乙醇提取物95%乙醇洗脫部分(ZC-Ⅴ)處理的肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC7721形態(tài)學(xué)變化Fig.6 Morphological changes of liver cancer cell HepG2 and SMMC7721 treated with ethanol crude extract washed with 95% ethanol (ZC-Ⅴ) from Zingiber striolatum root

2.3.2 MTT結(jié)果分析 通過(guò)分析HepG2細(xì)胞株和SMMC7721細(xì)胞株的相對(duì)存活率評(píng)價(jià)陽(yáng)荷根不同乙醇提取物的抗肝癌能力。與空白對(duì)照組(提取物濃度為0)相比，在圖示質(zhì)量濃度下，不同供試樣品對(duì)兩種細(xì)胞株的相對(duì)存活率均有一定程度的抑制，除95%乙醇洗脫物(ZC-Ⅴ)樣品外，其他樣品的細(xì)胞毒性不明顯，其中 ZC-Ⅴ對(duì) HepG2 和 SMMC7721 細(xì)胞株的 IC50值分別為 57.84 μg·mL-1、56.78 μg·mL-1(圖 7：A～D)。供試樣品對(duì)兩種細(xì)胞株的相對(duì)存活率效果一致。

圖7 陽(yáng)荷根乙醇提取物對(duì)HepG2和SMMC7721兩種細(xì)胞株細(xì)胞存活率的比較Fig.7 Comparisons of cell viability of HepG2 and SMMC7721 cell lines treated with ethanol extracts from Zingiber striolatum root

3 討論

應(yīng)用“相似相溶”原理，利用不同乙醇濃度(即極性不同)的洗脫溶劑將陽(yáng)荷根不同極性成分分離開(kāi)，然后將各部分富集，得到不同的供試樣品。含有不同成分的供試樣品具有不同的生物活性，體外模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陽(yáng)荷根 75%乙醇粗提取物(ZC)及其通過(guò)大孔樹(shù)脂不同濃度乙醇洗脫產(chǎn)物的生物活性具有顯著差異。和ZC相比，乙醇洗脫的部位抗氧化和抑硝化活性較高，從IC50值可知，粗提物50%乙醇洗脫部分(ZC-Ⅲ)對(duì)體外自由基 DPPH的清除效果和 25%乙醇洗脫部分(ZC-Ⅱ)的清除亞硝酸鹽能力雖僅為V?的1/20，就其作為日常蔬菜或者煲湯的常用材料而言，有較大的應(yīng)用前景，可在預(yù)防腫瘤方面大力推廣。據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)，95%乙醇洗脫物(ZC-Ⅴ) (IC50=56.7～57.8 μg·mL-1)具有顯著的抗肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)活性，即當(dāng)樣品質(zhì)量濃度分別僅為57.84、56.78 μg·mL-1時(shí)，兩種肝癌細(xì)胞的相對(duì)存活率達(dá)到50%，與姜科植物生物活性成分大多集中在弱極性或中極性部位的結(jié)果一致[21—22]，并且在ZC-Ⅴ部位濃度達(dá)125 μg·mL-1時(shí)，其對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率能達(dá)95%以上，這為其抗肝癌藥理活性提供理論支撐。